毕赤酵母功能活性研究进展

时间：2024-07-28

◎ 王晓萌，孙炜，张卓，庞琬月，师昊雯，檀建新

（河北农业大学食品科技学院，河北保定 071000）

毕赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）又称巴斯德酵母，因其既具有原核生物生长特性、操作简单，又具有真核细胞的翻译后修饰加工特性[1]，受到广大学者的关注与研究。P. pastoris以甲醇为唯一碳源，这种甲基营养型酵母菌是一种独特的生产系统，作为成熟的蛋白质表达宿主，其生长的细胞密度非常高，具有强大和严格调控的启动子，可使每升培养细胞产生胞内或胞外分泌的重组蛋白量达到克级[2-4]，已经广泛应用于生物制药和工业酶的生产[5]。毕赤酵母属的细胞呈现短椭圆形至圆柱形的菌落特征。近年来，对P. pastoris功能活性研究颇多，特别是高密度发酵活性、高效表达特性相关和免疫调节活性等。本文以P. pastoris、高效表达等为关键词，根据中国知网、Web of Science和Science Direct等数据库搜索结果，综述了P. pastoris功能活性研究进展，并从其作用途径或物质基础的角度进行归纳总结，以期为P.pastoris在高效表达载体中的进一步开发利用提供理论依据。

1 高密度发酵性能

高细胞密度发酵已被广泛应用于有大量生产价值的重组蛋白和发酵产品中，通过各种补料系统分批发酵，实现高细胞密度和高产品产量[6-8]，分批补料是介于分批发酵和连续发酵之间的一种常见发酵技术[9]，高细胞密度分批补料培养包括3个阶段，即酵母细胞培养阶段、甘油饲料阶段、混合饲料（GM）阶段[10-11]。ZHANG等[12]利用10 000 L的高细胞密度补料分批培养来生产异源植酸酶，并向其中加入甲醇诱导重组蛋白的表达，此外，实验还增加了转基因阶段，以改善毕赤酵母对甲醇环境的适应性。KAUSHIK等[13]研究了微量培养策略，这一策略可用于P. pastoris克隆的快速高通量筛选、培养基优化和高通量重组蛋白生产，在优化的培养条件下，细胞存活率为99%，解决了培养物混合不充分而造成的氧气供应不足等问题，该方法对于没有配备平行筛选微生物反应器设施的实验室具有巨大的价值。

2 异源蛋白的高效表达

P. pastoris适合高水平表达外源基因，目前用于生产各种工业酶和药物蛋白[14-15]，该物种具有大肠杆菌表达系统的许多优点[16]，同时克服了酿酒酵母[17]系统的许多缺陷，也有研究认为P. pastoris可能对自身一些不太重要的基因的转录减少，从而保存了能量和底物，促进了外源基因的表达[18]。基于已有研究，P.pastoris已经被证实具有高效表达能力，表1中归纳了P. pastoris表达载体多拷贝和启动子调控作用研究的研究对象、实验方法及相关结论。

表1 P. pastoris异源蛋白高效表达能力研究进展表

2.1 表达载体的多拷贝

P. pastoris可通过增加拷贝数来达到高产效果，这是由转录和翻译水平提高所致[19]。ZHOU等[20]从米曲霉NKY2017中鉴定了一种新壳聚糖酶（CCHA），该酶能有效地将壳聚糖转化为低聚糖，具有工业化生产壳聚糖的潜力，因此ZHOU等通过构建多拷贝质粒增加了目标基因的拷贝数以及重组蛋白的产量，实现了这一耐温酸性壳聚糖酶在P. pastoris中的高效表达；RAO等[21]以P. pastoris为受体菌，利用pH BM905BDM质粒构建了L-谷氨酸氧化酶（GLOD）和L-氨基酸氧化酶（AAO）的多拷贝表达质粒，L-谷氨酸对α-酮戊二酸（α-KG）的平均产率为6.22 g·L-1·h-1，最高的α-KG效价为124.5 g·L-1，表明在AAO条件下，L-谷氨酸对α-KG的平均产率为5.78 g·L-1·h-1，最高α-KG效价为115.6 g·L-1，表明P. pastoris与游离酶相比，将酶表达在P. pastoris上可显著提高酶的稳定性，更适用于工业应用，多拷贝质粒可以不同程度的提高外源蛋白的表达；WEI等[22]构建了4个含1～4个拷贝表达有机磷水解酶（OPHCM）的重组质粒，并将其转化至P. pastoris中，发现增加OPHCM基因的拷贝个数可提高OPHCM的表达水平，重组菌的酶活分别提高了57.6%和30.1%，重组OPHCM的高效表达和良好的特性为解决环境中有机磷农药的污染提供了有效的解决方案。

2.2 启动子的调控

严格调控且高效的启动子是P. pastoris高效生产重组蛋白的关键，由基因P. pastoris醇氧化酶I（AOX1）控制，醇氧化酶启动子（pAOX1）已经成为巴斯德酵母[23]中最常用的高效表达外源蛋白表达启动子。传统意义上来说，该启动子只有用甲醇培养细胞才能促进外源基因高水平的转录，但在其他碳源上培养细胞时会受到强烈的抑制，具有甲醇依赖性[24]。CÁMARA等[25]发现AOX1启动子调控的表达盒剂量的增加会导致P. pastoris过氧化物酶体的产生和甲醇代谢的转录衰减，这些现象与异源产物分泌减少同时发生，说明启动子与异源产物的高效表达密切相关。P. pastoris重组蛋白生产的新型高效无甲醇启动子也可以在无甲醇培养条件下实现对异源蛋白高效表达的调控[26]，MOMBENI等[27]利用基因工程方法构建了一种P. pastoris重组蛋白生产的新型高效无甲醇启动子，在pMOX的控制下，增加基因剂量和利用蛋白酶缺乏特性显著增加了报告蛋白内切葡聚糖酶3（CMC3）和内切葡聚糖酶II（EgII）的表达量。PRIELHOFER等[28]利用DNA微阵列技术成功地鉴定出一组新的调控启动子，无需甲醇即可诱导，新启动子PG1克隆在以葡萄糖为基础的间歇发酵中，与具有相同基因拷贝数的PGAP克隆相比，其生物量人血清白蛋白（HSA）特异性效价达到约230%，表明该启动子适用于葡萄糖基蛋白生产过程中重组蛋白的高水平表达。

3 P. pastoris的“桥梁”作用

P. pastoris作为常见的表达载体，可以作为中间“桥梁”使P. pastoris最大程度发挥免疫调节作用，P. pastoris可以通过调节细胞因子和免疫球蛋白等来实现免疫调节[29-31]。PYKHTINA等[32]获得了一株高效表达重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）的P. pastoris，重组酵母G-CSF还具有一种生长因子的特性，与天然G-CSF一样，它能维持骨髓细胞的活力，与在相同条件下培养的对照组细胞相比，减少了细胞凋亡的数目，此外，与在大肠杆菌中产生的一种商业药物相比，G-CSF的糖基化形式表现出更持久的作用，并在暴露后的第3 d和第4 d产生更多的母细胞和子细胞，重组酵母可引起骨髓中粒细胞系列细胞的增殖，从而调节免疫应答。EWA等[33]用P. pastoris制备重组粘蛋白研究了弓形虫幼虫抗原对小鼠脾细胞分泌细胞因子的影响，从离体培养的L2幼虫中收集弓形虫排泄分泌（TES）抗原，重组粘蛋白刺激小鼠脾细胞产生IL-5、IL-6和TGF-β，并下调TNF-α的生成，这说明TES抗原具有较强的免疫调节特性，能够诱导小鼠免疫细胞产生广泛的效应。FARNÓS等[34]以BALB/c小鼠为实验动物，用P. pastoris高表达的兔出血性疾病病毒（RHDV）VP60衣壳蛋白经鼻免疫后产生的免疫应答，其中第1组三剂纯化VP60蛋白，小鼠IgG反应最高，IgG1、IgG2a和IgG2b亚类表达最平衡，这组动物也产生了最高的T细胞增殖反应并检测出IFN-g和IL-12基因表达，表明用抗RHDV的非增殖疫苗抗原免疫后，能有效地激发细胞免疫，细胞免疫在保护免受许多病毒感染方面起着关键作用。