温浸法提取黑米中原花青素工艺的研究

◎ 闫高颖，张必荣，曹文娟，张 敏，熊悦清

（陕西天谷生物科技集团有限公司，陕西 西安 710065）

黑米是稻米中的珍贵品种，营养丰富，具有一定的保健作用。《本草纲目》记载，黑米具有滋阴补肾、健脾暖肝、明目活血的功效，又有“补血米”“长寿米”“神仙米”的美称。黑米含有人体所必需的氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素C及钙、铁、锌等矿物营养元素，还含有具药用价值的黑米原花青素[1-2]。

原花青素（Proanthocyanidind，PC）是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物，是目前国际上公认的清除人体内自由基有效的天然抗氧化剂，具有清除人体内自由基、抗氧化活性、抗致突变活性等生理作用。近年来，从植物中提取的原花青素作为功能性因子广泛应用于保健食品加工中，而原花青素基本结构单元的组成模式是其保健功能发挥的物质基础。

近年来由于原料价格上涨使原花青素生产成本大幅增加，失去了市场竞争中的价格优势，本项目通过查阅大量文献[3-7]，发现原花青素的含量对温度以及酸度比较敏感，因此以原花青素的抗氧化研究为突破口，针对原有的提取工艺进行优化，考察了提取环境对原花青素提取率的影响，提出一套新的工艺，以降低生产成本。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑米：市售；甲醇、乙醇、正丁醇、盐酸和硫酸亚铁铵溶液均为国产分析纯；原花青素标品购自天津市尖峰天然产物研究开发有限公司。

1.2 仪器与设备

SP22100UV型紫外-可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司生产；RE252AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂生产；DK29821型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司生产；DF204电热鼓风干燥箱，北京西城区医疗器械二厂生产；JAC-600超声波中药处理机，山东济宁超声电器有限公司生产。

1.3 黑米原花青素的提取

用粉碎机将干燥的黑米粉碎，精确称取10.0 g黑米粉末于200 mL容量瓶中，加入所需的60%酸化乙醇溶剂，在60 ℃下经水浴提取1 h。然后减压过滤，得到原花青素类物质提取液，提取液低温烘干以备检测。

1.4 黑米原花青素的测定

精密称取样品100 mg于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容。精密吸取2 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即为供试液。精密吸取该供试液1 mL于10 mL具塞试管中，加入2%NH4Fe（SO4）2·12H2O的2 mol·L-1盐酸水溶液0.2 mL，酸性正丁醇溶液6 mL，拧紧密封盖，摇匀，拧松密封盖。置95 ℃水浴中加热反应60 min，取出，在冰水浴中快速冷却，即得待测样品溶液。以标准样品代替样品，按样品溶液制备方法，处理即得标准品溶液。以甲醇代替样品供试液，按样品溶液处理，即得空白溶液。在546 nm处以样品空白溶液作为空白，测定标准品溶液和样品溶液吸收度。

样品原花青素含量按式（1）计算。

式（1）中，C为原花青素含量（%）；As、A为标准样品、样品吸收值；Ws、W为标准样品、样品称样量（mg）；S为标准样品含量（%）。

1.5 单因素实验

1.5.1 提取料液比的确定

用粉碎机将干燥的黑米粉碎。精确称取10.0 g黑米粉末5份分别于200 mL圆底烧瓶中，加入料液比为1∶10、1∶12、1∶14、1∶16和1∶18的60%醇溶液，60 ℃温浸提取2次，然后减压过滤，得到原花青素类物质提取液，低温烘干以备检测。计算原花青素的含量，确定最佳提取溶剂浓度。

1.5.2 提取时间的确定

取10.0 g黑米粉末10份，加入60%醇溶液中，提取在料液比为1∶16条件下，温浸提取的时间为1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，60 ℃提取2次，计算原花青素的含量，确定最佳提取时间。

1.5.3 提取温度的确定

取10.0 g黑米粉末各5份，加入60%醇溶液，料液比为1∶10，每次温浸提取1 h，提取2次，在提取温度为50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃条件下，计算原花青素的含量，确定最佳提取温度。

1.5.4 提取溶剂加酸量的确定

取10.0 g黑米粉末5份，加入60%酸化乙醇溶液，料液比为1∶16，每次温浸提取1 h，提取2次，在盐酸体积分数为0、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%条件下，计算原花青素的含量，确定最佳盐酸加量。

1.6 正交实验设计

根据温浸提取单因素的实验结果，选取提取温度（A）、盐酸体积分数（B）、提取时间（C）为主要因素，每个因素各选取3个水平，设计正交实验，确定最佳提取工艺。温浸提取正交实验水平因素见表1。

表1 正交实验水平因素表

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 提取料液比对原花青素含量的影响

从图1可知，料液比为1∶16时，提取液中的原花青素含量最高，为25.36 mg·g-1，因此选择1∶16作为温浸提取的最佳料液比。

2.1.2 提取时间对原花青素含量的影响

从图2可知，提取2 h的醇提取液中原花青素的含量最高，为40.69 mg·g-1，选择提取时间为2 h作为提取的最佳提取时间。

2.1.3 提取温度对原花青素含量的影响

从图3可知，提取温度为70 ℃时，提取液中原花青素的含量最高，为39.82 mg·g-1，因此选择提取温度为70 ℃作为温浸提取的最佳提取温度。

图1 提取料液比对原花青素含量的影响图

图2 提取时间对原花青素含量的影响图

图3 提取温度对原花青素含量的影响图

2.1.4 提取溶剂加酸量对原花青素含量的影响

从图4可知，盐酸体积分数为0.2%的提取液中原花青素的含量最高，为34.26 mg·g-1，选择盐酸加量为0.2%的提取条件作为最佳提取加酸量。

图4 提取溶剂加酸量对原花青素含量的影响图

2.2 正交实验结果分析

按照表1的正交实验水平因素安排，进行温浸提取实验，实验结果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 正交实验结果表

表3 方差分析结果表

由表3可知，采用温浸提取法提取黑米原花青素，以原花青素含量为主要考察指标，各因素对原花青素提取工艺影响的大小为A＞C＞B，即提取温度＞提取时间＞盐酸体积分数，其中提取温度对原花青素的提取率影响最大。在实验范围内，最佳的温浸提取条件是提取时间为2 h，料液比为1∶16，0.1%盐酸-60%醇，温度60 ℃，故需要对正交结果进行验证。

2.3 验证实验

通过单因素实验和正交实验，选择最佳提取工艺，并在此条件下进行两组验证实验，验证实验结果如表4所示。验证实验条件：①提取时间2 h，料液比为1∶16，0.1%盐酸-60%醇，提取温度为60 ℃。②提取温度60 ℃、料液比为1∶16盐酸体积分数0、提取时间2 h。

表4 验证实验结果表

3 结论

温浸提取的最佳工艺为：提取溶剂为0.1%盐酸-60%醇，提取料液比1∶16，提取温度为60℃，提取2次，每次2 h。按此工艺进行中试放大实验，实验结果表明，该工艺下的平均产品回收率为149.3%，提取物的平均含量为32.1mg·g-1，相比于传统工艺，新工艺提取法所得结果比老工艺提取法所得产品收率更高，该提取工艺稳定，可用于大批量生产。