九月黄乳酸菌发酵饮料工艺优化研究

◎ 杨春敏，王燕云，黄建初

（广州工商学院，广东 广州 510850）

九月黄，别名预知子、木通子等，是一种野生藤本水果[1]，味道鲜美，甘甜可口，风味独特，营养丰富，富含糖、黄酮、维生素C及多种氨基酸[2]。乳酸菌是一类能以糖为原料的益生菌，发酵产品具有抗氧化、改善机体免疫力、促进机体生长发育等功效[3]，乳酸菌发酵还能有效提高产品风味、营养价值和货架期[4]。

九月黄果实鲜甜味美，口味独特，是一种较理想的乳酸菌发酵原料，但是目前关于乳酸菌发酵九月黄的产品鲜有报道。本文以九月黄为原料，采用植物乳杆菌和嗜热链球菌组成的复合菌种对九月黄进行发酵，并对发酵工艺进行优化，旨在为开发九月黄乳酸菌发酵产品提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

九月黄为市售，产自福建省龙岩市；植物乳杆菌JYLP-002、嗜热链球菌JYST-26，山东中科嘉亿生物工程有限公司生产。蔗糖为市售，产自浙江省；MRS肉汤，北京奥博星生物技术有限责任公司生产。

1.2 仪器与设备

JY2002电子天平（上海衡平仪器仪表厂）、FP3010榨汁机（德国博朗公司）、TL-08X无菌均质机（江苏天翎仪器有限公司）、YX-24HDD型手提式压力蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备有限公司）、SW-CJ-2FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、TGL-16MS台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）、移液枪（大龙兴创实验仪器（北京）股份有限公司）、SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、BMJ-160型霉菌培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、TD-35数显折光仪（杭州汇尔仪器设备有限公司）、PHS-3C pH计（仪电科学仪器）、V-1000型可见分光光度计（翱艺仪器（上海）有限公司）及BCD-318WTPZM（E）美的冰箱（合肥美的电冰箱有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

九月黄发酵饮料工艺流程：九月黄→去皮→加水榨汁打浆（九月黄果肉∶水=1∶3，质量比）→过滤、去籽→榨汁→均质→添加蔗糖→高压蒸汽灭菌→接种→发酵→成品。

1.3.2 操作要点

（1）原料选择。选用健康、新鲜的九月黄。

（2）榨汁、均质。将九月黄洗净后剥皮，加水榨汁打浆（九月黄果肉∶水=1∶3，质量比），经无菌纱布过滤后进行无菌均质。

（3）灭菌。将分装在三角瓶中九月黄果浆放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌。

（4）乳酸菌保藏发酵剂的选择。先将两种乳酸菌的保藏发酵剂分别放入MRS肉汤中，然后置于MRS肉汤（30 ℃，静止）中恒温培养24 h。

（5）九月黄果浆乳酸菌发酵培养。果浆经过灭菌，冷却后，置于一个无菌的操作平台上。然后将乳酸菌体中的发酵剂（菌体浓度：8.0～9.0 lgCFU·mL-1），在6 000 r·min-1的温度条件下对其进行10 min的离心处理后舍弃一次上清液，然后再加入灭好菌的生理盐水，使乳酸菌体重悬。将重悬的乳酸菌体接入已经灭好菌的九月黄果浆中，置于37 ℃下继续培养。

1.3.3 复合乳酸菌发酵九月黄单因素实验

单因素实验的因素固定水平为：发酵时间24 h、发酵温度37 ℃、蔗糖添加量5%、菌株接种量5%及菌株接种体积比（嗜热链球菌∶植物乳杆菌）1∶1，在固定水平的单因素实验中每次只改变一个因素的水平值，探究蔗糖添加量（3%、5%、7%、9%）、发酵温度（35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、菌株接种量（1.5%、2.0%、2.5%、3%）、发酵时间（24 h、48 h、72 h、96 h）对九月黄乳酸菌发酵饮品的活菌数、pH值和可溶性固形物的影响。

1.3.4 复合乳酸菌发酵九月黄正交实验

根据单因素实验的结果，选取蔗糖添加量（A）、发酵温度（B）、菌株接种量（C）和发酵时间（D）4个因素采用正交表L9（34）进行正交优化实验，考察其对复合乳酸菌活菌数的影响，确定九月黄乳酸菌发酵饮品的最佳发酵工艺条件。正交实验因素水平见表1。

表1 因素水平表

1.3.5 指标测定

pH值的测定：本实验通过pH计直接测定，平行测3次取平均值确定pH值。

可溶性固形物的测定：本实验参照NY/T 2637—2014[5]法执行，采用TD-35数显折光仪检测可溶性固形物的含量，在室温下测定3次取平均值。

乳酸菌活菌数的测定：本实验采用固体MRS培养基稀释平板活菌计数法，稀释至10-7后涂板检测[6]对乳酸菌活菌数进行测定。根据GB 4789.35—2016对样品乳酸菌总数进行检测。

1.3.6 数据处理

数据处理、极差分析以及图表制作均通过Microsoft Office Excel 2010软件完成。

2 结果与分析

乳酸菌在不同的发酵因素下产酸能力不同，故可以根据发酵后发酵基质的pH值判断菌种的生长情况，pH值越低，说明产酸能力越强。乳酸菌的活菌数是对乳酸菌生长情况最直接的描述。可溶性固形物主要包括单糖、双糖和多糖等可溶性糖类，通过测定发酵过程中可溶性固形物的变化可以判断微生物利用糖的情况。因而选用pH值、活菌数和可溶性固形物这3个指标判定乳酸菌在九月黄发酵液中的生长情况。

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 蔗糖添加量对pH值、活菌数和可溶性固形物的影响

从图1和图2可知，随着蔗糖添加量的增加，乳酸菌的活菌数先下降再上升，最后趋于稳定。在蔗糖添加量为7%～9%的范围内，活菌数的变化波动较小，在蔗糖添加量为3%时活菌数最多。嗜热链球菌和植物乳杆菌均能利用蔗糖作为碳源。但在氮源含量不变的情况下，单方面提高蔗糖添加量容易造成基质中的碳氮比失衡，从而导致乳酸菌提早衰亡；此外蔗糖含量过高会造成高渗透压环境，对乳酸菌有一定的脱水作用，可抑制其生长[7]。由于蔗糖也属于可溶性性固形物，所以蔗糖添加量在9%时可溶性固形物达到的最大值。在此条件下，复合乳酸菌发酵九月黄的适宜蔗糖添加量为3%。

图1 蔗糖添加量对九月黄发酵液的pH值、活菌数的影响图

图2 蔗糖添加量对九月黄发酵液的可溶性固形物的影响图

2.1.2 发酵温度对pH值、活菌数和可溶性固形物的影响

过低或过高的温度都会导致细胞内酶活下降，影响产酸能力和发酵速度，不利于乳酸菌的生长。从图3中可以看出，发酵温度对活菌数的影响较大，在35～39℃的范围内，随着温度的升高，活菌数呈现不断增加的趋势，在39 ℃时活菌数达到峰值，此时pH值也最低。从图4可以看出在39 ℃条件下可溶性固形物含量也呈现出最大值。嗜热链球菌属于嗜热型微生物，细胞内的酶和蛋白质具有较强的抗热性，能在50 ℃以内的温度下生长；但植物乳杆菌属于嗜温微生物，温度高于40 ℃，细胞内酶的催化能力会大大降低，甚至会导致其丧催化活性，从而影响菌株的正常生长[8]。因此，本实验选择39 ℃作为适宜发酵温度。

2.1.3 菌株接种量对pH值、活菌数和可溶性固形物的影响

菌株进入对数生长期的速度和菌株的生长周期会受菌株接种量的影响。从图5中可以看出，在菌株接种量增加的过程中，乳酸菌的活菌数呈现先增后减的趋势，当接种量为2%时，活菌数达到大值14.945 lgCFU·mL-1，此时的pH值为3.78。在菌株接种量较低的条件下，乳酸菌繁殖基数小，活菌数增长比较慢。从图6可知，在接种量为2.0%时可溶性固形物含量达最高值为12%，而加大接种量则能有效缩短延滞期，也能使九月黄浆液中的营养物质被充分利用；但九月黄发酵液所能提供的营养物质又是有限的，接种量过大会使营养物质被过快消耗，同时产生大量的代谢产物，导致部分乳酸菌缺乏生长所需的能量，生长受到限制并提早进入衰亡期[9]，所以可溶性固形物的含量会随着菌株接种量的增加而随之减少。综合考虑，本实验选择2.0%作为复合乳酸菌发酵九月黄的适宜菌株接种量。

2.1.4 发酵时间对pH值和活菌数的影响

乳酸菌发酵产酸量及发酵的完全程度[10]受发酵时间影响。在发酵过程中，乳酸菌利用九月黄浆液中的糖作为碳源，在对数生长期内快速增长，同时产生大量有机酸。当有机酸积累到一定程度后，乳酸菌活力下降，同时基质中的营养物质被大量消耗，营养物比例逐渐失衡，使得其走向衰亡期。从图7中可以看出，随着发酵时间的延长，活菌数先增加后减少，而pH值则呈现持续降低趋势。发酵72 h后活菌数值达到最高为32.930 lgCFU·mL-1。从图8中可以看到随着发酵时间的延长，可溶性固形物的含量整体上呈现下降的趋势，这可能是九月黄发酵液中的可溶性物质在乳酸菌发酵过程中被水解利用。在发酵72 h之后乳酸菌的活菌数趋于稳定，而可溶性固形物含量的变化也同样趋于稳定，这说明乳酸菌活菌数的增加与可溶性固形物的减少密切相关，同时证明乳酸菌可以利用九月黄可溶性固性物作为其营养物质。综合考虑，本实验确定复合乳酸菌发酵九月黄的适合发酵时间为72 h。

图3 发酵温度对九月黄发酵液的pH值、活菌数的影响图

图4 发酵温度对九月黄发酵液的可溶性固形物的影响图

图5 菌株接种量对九月黄发酵液的pH值、活菌数的影响图

图6 菌株接种量对九月黄发酵液的可溶性固形物的影响图

图7 发酵时间对九月黄发酵液的pH值、活菌数的影响图

图8 发酵时间对九月黄发酵液的可溶性固形物的影响图

2.2 正交实验结果与分析

各因素水平的改变对实验结果的影响程度取决于极差值的大小，若极差值越大，说明该因素对乳酸菌发酵果蔬汁的影响就越大。通过对正交实验表的极差值分析，由表2中正交实验结果可知，4个因素的极差值大小排序为：RD＞RA＞RC＞RB，即4各因素对九月黄乳酸菌发酵饮品发酵体系中活菌数的影响大小排序为：发酵时间＞蔗糖添加量＞菌株接种量＞发酵温度。正交实验结果和分析k值可知，当蔗糖添加量为3%、发酵温度为39 ℃、菌株接种量为2.0%、发酵时间为72 h时的活菌数达到最多为20.072 lgCFU·mL-1，即得到最优发酵工艺方案为A1B2C2D2。欧阳佳等[10]选择嗜热链球菌和其他植物乳杆菌两种菌作为复合发酵菌种，发酵淮山，在菌株接种量、蔗糖添加量分别为5%、3%，嗜热链球菌∶其他植物乳杆菌体积比为1∶1、发酵持续时间为16 h、发酵温度为40 ℃条件下的活菌数均可达到8.62 lgCFU·mL-1本实验取得了与之相近的研究结果。

表2 发酵工艺参数正交实验方案和实验结果表

3 结论

本研究以野果九月黄为单一原料，采用嗜热链球菌和植物乳杆菌的混合菌发酵九月黄浆液制成乳酸菌饮料，以pH值、乳酸菌活菌数和可溶性固形物含量作为评价指标，通过单因素实验和正交实验确定了九月黄乳酸菌发酵饮料的最佳发酵工艺为蔗糖添加量3%、菌种接种量2.0%、发酵时间72 h、发酵温度39 ℃，活菌数超过20.072 lgCFU·mL-1。同时，发酵过程中可溶性固形物含量的变化表明乳酸菌能利用九月黄中的可溶性固形物。此研究所用原料丰富、风味独特、制备工艺简单，为九月黄乳酸菌发酵饮料的生产和加工提供了一定的理论基础和实验支撑，也进一步丰富了九月黄产品的种类。