贵州茅台酒高温发酵工艺中酵母的应激机制分析

时间：2024-07-28

◎何宇

（贵州省仁怀市茅台镇怀茅酒厂，贵州仁怀 564501）

茅台酒是我国国酒品牌之一，由于贵州省仁怀市茅台镇独特的水源、土壤以及气候点等特，使得利用该地区微生物和水源酿制的酱香型白酒的味道独特，留香持久。在酿制过程中主要是通过高温制曲、堆积、发酵、流酒以及多刀蒸馏和发酵技术才能够得出纯正的茅台酒，根据现代科技研究茅台酒中所含有的微量元素种类超过了1400种，是普通酱香型白酒的近3倍。

1 酵母在高温发酵过程中的应激反应种类

1.1 氧化应激反应

在酿酒过程中外界的环境很容易对菌体造成影响，使活性氧类物质大量累积，当其累积到一定浓度后就会对酵母菌细胞内的物质产生破坏，如变性、断裂蛋白质链等，使细胞产生死亡。但酵母菌已经进化出能够在此情况下保护自身的特性，主要利用酶类或非酶类物质使其细胞内物质保持原始状态，进而降低氧化应激反应对其影响。

1.2 高温应激反应

茅台酒在酿制过程中需要进行高温发酵，而通常酵母发酵的稳定应控制在33℃左右，最高不得超过36℃，但在发酵后期酒糟当中的温度必然无法有效控制，导致酶类物质因受热而出现钝化，使得发酵情况停止。而酵母菌本身耐热应激机制较为复杂，需要接触耐热蛋白、海藻糖、应激糖蛋白等的帮助。

1.3 酒精应激反应

酵母对酒精的耐受度也有一定的限制，如果超过该临界值就会毒害酵母菌。与高温应激反应相似，高浓度酒精同样能够刺激酵母产生海藻糖，而海藻糖除了可以抵消高温应激反应，还可以抵消酒精应激反应对细胞膜的毒害作用，稳定细胞膜表面蛋白质活性。

2 茅台酒高温发酵工艺中酵母的应激机制实验

2.1 实验材料

本次实验所涉及的实验试剂包括无水乙醇、PMSF、Chaps、尿素、脲、Agarose NA、Tris、冰乙酸、盐酸、十二烷基硫酸钠、IAM、DTT、丙烯酰胺、NP40、甲醛、正丁醛、硝酸银、麦芽糖、甘油、磷酸、戊二醛、过硫酸铵、蛋白胨、蔗糖、葡萄糖、氯化钙、碳酸钠以及甲醇等。所使用的实验器材则包括手持式折光仪、电子天平、恒温水浴锅、pH试纸、紫外分光光度仪、电热干燥箱、真空干燥箱、液氮容器罐、磁力恒温搅拌器、万用炉、培养箱、大容量恒温振荡器、电泳仪、超声细胞粉碎机、摇床以及离心机等。

2.2 实验方法

2.2.1 实验培养基配置

称取麦芽粉，将其按照1∶4的比例与水进行混合，并在恒温磁力搅拌器当中进行糖化，温度设定在67℃，糖化时间为5 h，然后将液体用纱布进行过滤。根据一份蛋清可以澄清1000ml糖化麦芽粉的比例添加蛋清，并放入水浴锅中煮沸，再次利用纱布过滤，并在恒温灭菌锅内灭菌30m in，放入冰箱内备用。

2.2.2 菌种的活化和培养

将利用斜面保存的实验菌种接种在配置的麦芽培养基上，在30℃的恒温条件下培养3d，获得子一代菌种，然后再将其进行转接，同样放置于30℃恒温条件下培养2d，获得的菌种供实验使用。利用接种环分三次将适量的菌种接种在麦芽培养基上，在温度设定为30℃的恒温振荡器当中以每分钟170 r的频率培养10 h，并根据每250 ml麦芽培养基上接种振荡培养总量6%的接种量将其进行转接，以同样的条件在恒温振荡器中进行培养，获得实验用种菌液。

2.2.3 酵母存活率的测定

将处于对数生长期内的酵母细菌分成若干等分，同时使其接受高温和酒精的刺激，每种刺激时间约为0.5h。使用消毒的蒸馏水将菌液分别稀释1～5倍，取稀释后的菌液进行涂板。每个浓度的菌液分别平行涂板三次，在30℃的恒温培养箱当中培养约32 h，将其与未产生应激反应的酵母菌进行对比。

2.2.4 蛋白质的定量

将培养后收集的菌体转移到容量为15 ml的离心管当中，用10 ml的无菌蒸馏水对其进行清洗，在振荡均匀后禁止沉淀。随后在恒温离心机内离心约5 min，温度设定为10℃，速率为2000 r，保留沉淀物质。重复离心两次后保留沉淀物质，并加入1 ml的无菌蒸馏水溶解，再次用每分钟3000 r的速率进行离心，保留沉淀物获得实验测量的蛋白质。在试管当中加入蛋白质抑制剂，消除其蛋白质的增多，并利用冰浴超声破碎方法打破其细胞壁，约破碎10 min，并利用每分钟2000 r的速率进行离心，保留上清液。在上清液当中加入5倍体积的丙酮混合液，在零下20℃条件下沉淀，离心后保留沉淀物，再次用丙酮将混合液中的TCA洗脱，二次冷藏和离心，重复操作两次后保留沉淀物。

2.3 实验结果

菌株在培养实验当中两种酵母菌株的生长延滞期数据相差不大，但是在对数生长期当中酿酒酵母的生长速率明显要高于普通酵母，菌体的数量也达到了峰值。以单纯高温对菌株进行刺激的实验可以看出，在48℃连续刺激30～40 min菌株的活性最大，说明此时其呼吸能力较强，但随着高温刺激时间增加，菌株活性减弱，在超过60 min时活性降低到最低点，说明酵母菌发生死亡。而在单纯酒精刺激时，在20～30 min之间菌株的活性最强，并且在30 min时活性达到峰值，但之后随着刺激时间的增加菌株的活性明显下降。利用高温和酒精双重因素刺激时，温度控制在46℃，酒精浓度为2%，此时在刺激20 min后菌株活性达到峰值，随后降低。