基于固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定饮用水中14种抗生素

谢文佳 孙晓霞 王前 陈蕾 李轲

（1.河南省产品质量监督检验院，河南郑州 450047；2.郑州海关技术中心，河南郑州 450003）

随着人类社会的进步，医药科技的不断发展，国内抗生素滥用问题已经相当严峻，而水体环境中的抗生素残留污染状况也不容乐观，特别是地下水、水源水中也有检出，直接影响到生活饮用水中的抗生素污染残留。目前抗生素的检测方法多为食品中的兽药残留检测，生活饮用水中的检测方法则较为少见。已有的抗生素残留的检测方法有光谱[1]、色谱、免疫[2,3]、电化学[4]、毛细管电泳[5]、微生物法[6]以及其他新型检测技术[7]等。目前应用相对比较多的是色谱法，该类方法灵敏度高，检出限低，重复性好[8]，其又可细分为液相色谱-高分辨质谱联用技术[9,10]、液相色谱-串联质谱联用技术（HPLC/MS/MS）[11,12]、超高效液相色谱串联质谱（UPLC/MS/MS）[13,14]、高效液相色谱[15,16]等。研究表明，进入水环境中的各种抗生素种类较为繁多，并且以ng/L（ppt级别）甚至更低的浓度存在[17]。另外不同水体其基质不同，含有的干扰物也不同，因此，选用合适的方法对于水中抗生素的检测就显得格外重要。液相色谱法适合于含量比较高的抗生素的测定，液相色谱-高分辨质谱法虽定性功能强大，但定量准确度上稍差些，因此本研究采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC/MS/MS）法，其检测限度相对较低，定量准确，经前处理进化浓缩后，可达到ng/L（ppt级别）的检测水平，能准确有效的检测出低含量的抗生素。

本文选择了用量大、易进入水体造成污染的4类抗生素[18,19]（磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类），利用固相萃取富集前处理，建立了水中14种抗生素同时定量检测的分析方法，可在25 min内完成14种目标抗生素的分析，并成功在多种生活饮用水的水体内进行目标抗生素的测定。因此本方法可应用于对生活饮用水的抗生素残留的检测监控。

1 实验部分

1.1 仪器

TQS三重四极杆串联质谱仪（美国Waters公司）、默克supelco固相萃取仪（德国默克）、N-EVAP-24氮吹仪（美国organomation）。

1.2 试剂、耗材

标准品：磺胺甲基嘧啶（99.7%）、磺胺甲噁唑（99.5%）、磺胺二甲嘧啶（99.4%）、磺胺间甲氧嘧啶（94.2%）、甲氧苄氨嘧啶（99.1%）、磺胺间二甲氧嘧啶（99.4%）、四环素（纯度94.2%）、土霉素（96%）、金霉素（92.5%）、恩诺沙星（99.9%）、环丙沙星（92.3%）、诺氟沙星（97.2%）、氧氟沙星（95.7%）、罗红霉素（96.2%），所购标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。实验中所用到的试剂甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、盐酸（分析纯）等均购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

耗材：Waters Oasis PRIME HLB SPE固相萃取柱（美国Waters公司）。

1.3 标准溶液的配制

标准储备液：分别准确称取各标准品10.00 mg各置于100 mL容量瓶中，用纯甲醇溶解后定容至刻度，单标标准溶液浓度为100.0 μg/mL，于4℃密封保存。

混合标准中间液：分别移取上述五种磺胺类化合物标准储备液1.00 mL，分别准确移取四环素类、喹诺酮类、大环内酯类标准储备液5.00 mL置于100 mL容量瓶中，用10%甲醇水定容。其中，磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶单标化合物浓度均为1000 ng/mL；四环素、土霉素、金霉素、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、罗红霉素单标化合物浓度均为5000 ng/mL。

混合标准工作液：移取混合标准中间液5.00 mL置于50 mL容量瓶中,用10%甲醇水定容。该溶液磺胺类单标浓度为100 ng/mL,四环素类、喹诺酮类、大环内酯类单标浓度为500 ng/mL。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：UPLC BEH C18 Column（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱温：40℃，流速：0.2 mL/min，进样量：5 μL，运行时间：25 min，流动相：A（甲醇）+B（体积分数0.1%甲酸水溶液），梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相的梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件电离方式

质谱测试参考条件：

a)离子源：电喷雾离子源；

b)扫描方式：正离子模式（ESI+）；

c)检测方式：多反应监测（MRM）；

d)毛细管电压：2.5 kv；

e)离子源温度：150℃；

f)脱溶剂温度：400℃；

g)脱溶剂气流速：900 L /hr，碰撞气流速为0.15 mL /min。

表2 各目标分析物的质谱参数

1.5 样品前处理方法

室温下取生活饮用水样100 mL，加入0.02 g EDTA，加盐酸调节pH=3。用Qasis PRIME HLB SPE小柱（500 mg/6 ml）预先用甲醇和水活化后，将上述水样过柱。5 mL水淋洗后用6 mL～8 mL甲醇洗脱目标组分。将洗脱液氮气吹干后加1 mL 10%甲醇水溶液复溶，待上机测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件优化

2.1.1 色谱条件优化

分别考察了Waters BEH C18和Waters HSS T3两款液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）对抗生素的分离效果，结果显示当A相采用乙腈作为流动相时，HSS T3色谱柱分离效果更好，而采用甲醇作为流动相时，BEH C18色谱柱分离效果更好。由于乙腈和甲醇相比，毒性更大，价格更高，因此本实验采用Waters BEH C18色谱柱，甲醇+体积分数0.1%甲酸水溶液作为流动相，25 min内14种目标化合物均可得到良好的分离。

2.1.2 质谱条件优化

取上述混合标准工作液分别进样，进行全扫描确定分子离子峰，然后以分子离子峰为母离子，对其进行轰击以获得二次碎裂产生的子离子。将分子离子和2个信号强度适宜的子离子组成监测离子对，以多反应检测模式（MRM）进行定性和定量分析。在此基础上优化了对灵敏度影响较大的碰撞能量和碎裂电压，从而使特征离子的丰度和比例达到最佳。

2.2 固相萃取柱的选择

吸附剂的选择是保证高效萃取效率的基础。测定水体中的农药一般采用如C18、C8等非极性吸附剂，而亲水亲脂平衡（HLB）型固相萃取柱，对极性和非极性物质都有很好的回收率和重复性，因此也常被用于类似研究。所以本次实验对比研究了C18、Oasis PRIME HLB这2种固相萃取小柱对空白水样加标的萃取回收率。实验结果表明，Oasis PRIME HLB小柱对14种抗生素均具有较好的回收效果，且重复性更好。可能是C18的填料对于这些化合物吸附性较强，难以洗脱或是这些物质极性较强而对其没有吸附效果，造成回收效果不理想。因此最终选择Oasis PRIME HLB作为固相萃取柱。

2.3 洗脱液的确定

实验对比了乙酸乙酯、乙腈、甲醇三种溶剂的洗脱效果。实验采取单人六平行加标实验，取其平均值，计算回收率。结果表明，乙酸乙酯仅对磺胺类化合物的洗脱回收能力较好；乙腈对磺胺类、四环素类的洗脱回收能力较强；而甲醇对磺胺类、四环素类、大环内酯类、氟喹诺酮类抗生素的回收率都比较好，回收率范围为70%～95%（见图1），因此，实验选取甲醇作为洗脱溶剂。

图1 三种不同洗脱液对实验回收率的影响

2.4 方法的线性范围与检出限

在优化实验条件下，对生活饮用水中14种目标抗生素进行测定，在0.5 ng/mL～100 ng/mL均得到良好的响应和分离，各标物测定的线性范围如表3所示，相关系数为0.9978～0.9996，以3倍信噪比（S/N=3）计算方法的检出限，其结果见表3。

表3 测试14种抗生素线性方程、相关系数（r2）和方法检出限

2.5 方法回收率、精密度和重现性

本实验以家用制备纯水和自来水为基底，依据我国主要流域的抗生素（包括磺胺类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类）的浓度分布（几个至上千个ng/L）[20]设计出10倍、20倍、50倍检出限和1 ug/L四个水平浓度进行加标，加标后按照1.4节的方法处理，每个浓度水平，各取6个平行样品，计算各目标抗生素的平均回收率和相对偏差，结果见表4。从结果可以看出，纯水中各抗生素的回收率范围为：70.5%～95.8%，RSD范围为：1.0%～4.7%，自来水中各抗生素的回收率范围为：62.0%～86.9%，RSD范围为：2.0%～6.9%，回收率、RSD均符合分析要求，表明该方法有较好的重现性和准确性，也显示出本方法对实际生活饮用水中抗生素分析的实用性和有效性。

表4 测试14种抗生素方法回收率和精密度

2.6 水样储存介质对方法回收率的影响

在样品测试过程中发现，水样的存放介质对样品的测试结果有很大的影响。本实验中以自来水为基底，采用玻璃和塑料两种介质作为样品存放容器，按照10倍、20倍、50倍检出限和1 ug/L四个水平浓度进行加标，加标后各存放3天后，按照1.4节的方法处理测定，结果如表5。从结果可以看出，存放于塑料容器中的水样回收较差，甚至出现检测不出来的情况，而玻璃容器的回收则符合分析要求，结果表明塑料容器对于水样抗生素有一定的吸附，因此在进行水样检测时，对测试水样应选用玻璃容器存放。

表5 自来水中加标测试回收率（单位：%）

3 结论

本研究采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱（SPEUPLC-MS/MS）技术，通过优化色谱条件、质谱条件、固相萃取柱类型、洗脱液及水样存放容器，建立了生活饮用水中4大类14种抗生素同时分析测定方法。所分析的14种抗生素在0.5 ng/mL～100 ng/mL都有较好的线性，相关系数大于0.99，检出限0.5 ng/L～5 ng/L，自来水基质加标回收率在62.0%～86.9%，相对标准偏差RSD在2.0%～6.9%，该方法有良好的灵敏度和稳定性，为生活饮用水中典型抗生素的分析提供了一种快速、准确可靠的分析方法，也为监控我国生活饮用水的抗生素污染水平提供了技术支撑。