ATRP 技术制备单分散树脂接枝聚乙烯基咪唑的色谱固定相及其在核苷类化合物分离中的应用

郑庆忠，贾 玮，龚波林

（1.宁夏大学化学化工学院，宁夏银川 750021；2.宁夏大学天然气转化国家重点实验室培育基地，宁夏银川 750021）

核苷类物质因具有抗病毒、抗肿瘤活性，市场需求日益加大，但核苷类药物的生产还面临很多亟待解决的问题，其中，探索高效的分离介质和技术就是一个重要的研究课题。

目前，由“点击化学”硅胶键合烯丙基咪唑固定相已经成功地应用于酚类、胺类有机化合物，无机阴离子等的分离[1]，但以单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯聚合物（PGMA/EDMA）微球为基质，键合乙烯基咪唑在以上提到的几类物质及核苷类物质分离中的应用尚未见报道。本文以PGMA/EDMA聚合物微球为基质，在原子转移自由基聚合（Atom Transfer Radical Polymerization，ATRP）技术下[2-6]，将聚乙烯基咪唑键合于聚合物微球表面制备得聚乙烯基咪唑色谱固定相，并成功地应用于核苷类化合物的分离。

1 实验

1.1 仪器及试剂

LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司），傅里叶变换红外光谱仪（上海精宏实验设备有限公司），CGY-100 型高压气动泵（北京福思源机械加工部），KQ-250B 超声波清洗器（昆山市超生仪器有限工司），JY92-II 超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），XSP-3CA1 生物显微镜（上海光学仪器六厂），LD5-2A 型低速离心机（北京医用离心机厂）。聚乙烯吡咯烷酮（PVP），过氧化苯甲酰（BPO），偶氮二异丁腈（AIBN），十二烷基磺酸钠（SDS），聚乙烯醇（PVA），乙烯基咪唑（VI），溴异丁酰溴（BrIBuBr），2，2-联吡啶，尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷及其他所用溶剂均为国产分析纯试剂。实验用水均用电阻率为18.3 MΩ·cm去离子水。

1.2 实验方法

1.2.1 合成单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯（PGMA/EDMA）微球 取采用分散聚合法制备粒径为3 μm 的线性苯乙烯（PS）种子若干于三颈瓶中，采用一步种子溶胀聚合法，加入适量的0.2 % SDS 溶液，在室温下进行搅拌活化。取一定量的甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、过氧化苯甲酰（BPO）于干燥的烧杯中，超声使过氧化苯甲酰完全溶解，然后加入一定量的甲苯、环己醇、PVA 和SDS，置于超声波细胞破碎仪中进行超声乳化至无油滴后，迅速加入到活化后的聚苯乙烯种子溶液中，室温下搅拌溶胀24 h，按照文献方法[7-8]制备了粒径为7 μm 的单分散多孔PGMA/EDMA微球。将合成的PGMA/EDMA微球装入索式提取仪中，用甲苯抽提48 h。抽提后的微球用无水乙醇、丙酮洗涤，60 ℃下真空干燥，即得7.0 μm 亲水性单分散交联PGMA/EDMA微球。

1.2.2 PGMA/EDMA微球的化学改性 将一定量干燥后的PGMA/EDMA微球加到0.1 mol/L 稀硫酸中，水浴加热下搅拌反应24 h，停止反应后大量水洗至中性，再分别用乙醇，丙酮洗涤三次，45 ℃真空干燥24 h，得酸化微球。取上述酸化微球置于100 mL 圆底烧瓶中，加入一定量的无水THF，搅拌1 h 后，冰浴下加入2 %的三乙胺，30 min 后，缓慢加入2 %的溴异丁酰溴，室温下反应24 h。用无水THF、水、丙酮依次洗涤后，置于40 ℃下真空干燥，制备得高分子溴引发剂。

图1 乙烯基咪唑色谱固定相的合成路线Fig.1 Synthetic approach to poly-vinylimidazole chromatogram stationary phase

1.2.3 乙烯基咪唑聚合物固定相的制备 按照摩尔量引发剂：催化剂：配位剂：单体=1：1：5：100 在100 mL圆底烧瓶中加入一定量乙烯基咪唑（VI）单体在若干溶剂甲苯中超声分散均匀。在另一个100 mL 圆底烧瓶中加入上步所得溴引发剂2 g，0.4 mmol 氯化亚铜，0.4 mmol 的氯化铜和2 mmol 的配体-联吡啶，抽真空-通N230 min，在45 ℃下搅拌反应6 h。反应结束后离心、洗涤，40 ℃下真空干燥，制得弱阴离子交换色谱填料。乙烯基咪唑键合PGMA/EDMA聚合物微球的离子交换色谱填料的合成路线（见图1）。

1.3 固定相的表征

合成的固定相颗粒大小与改性后聚合物的表观形态用扫描电子显微镜观测；傅里叶红外光谱仪进行红外光谱表征；元素分析分别测定PGMA/EDMA微球和ATRP-1 色谱固定相的C，H，N 元素的含量。根据公式（1）计算得乙烯基咪唑色谱固定相的键合量。

式中：%N-单位体积色谱固定相表面N 元素的百分含量；NN-单位体积的单体中N 元素的个数；MN-N元素的相对分子质量。

1.4 色谱柱的装填及色谱条件

以甲醇为匀浆液、蒸馏水为顶替液，在30 MPa 压力下以匀浆法分别将自制的乙烯基咪唑色谱填料装入不锈钢柱管（10 cm×0.46 cm I·D）中并标号为ATRP柱。（1）色谱条件：甲醇与水；（2）检测波长：245 nm。所有流动相在使用前均经0.45 μm 滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 乙烯基咪唑色谱固定相的结构表征

红外光谱和元素分析表明，乙烯基咪唑单体被成功接枝到PGMA/EDMA微球上，根据式（1）计算得乙烯基咪唑色谱固定相中乙烯基咪唑的键合量为3.98%。

2.2 乙烯基咪唑色谱柱在核苷分离中的应用

亲水作用色谱（HILIC）作为一种分离极性化合物的液相色谱模式，近年来越来越受到关注和重视。主要是因为强极性化合物的分离问题引起了各个研究领域的重视，其次是由于亲水作用色谱具有流动相组成简单、分离效率较高、与质谱兼容以及反压较低等优势[9]。随着流动相极性的改变，用几种核苷类化合物来考察ATRP 柱在HILIC 模式下的分离的性能（见图2）。

图2 聚乙烯基咪唑柱对7 种核苷的色谱分离图Fig.2 Chromatogram of seven nucleosides by poly-vinylimidazole column

由图2 所示，咪唑官能团作为原子转移自由基聚合改性单体键合于交联甲基丙烯酸环氧丙酯树脂表面制备所得聚乙烯基咪唑聚合物填料具有一定的亲水作用。在以乙腈-醋酸铵水溶液（92：8，V/V）作为流动相时，流速：1 mL/min，检测波长为254 nm 的条件下同时分离7 种核苷类强极性化合物，45 min 内达到基线分离。乙腈含量对7 种核苷类混合物的保留时间也有一定的影响，考察乙腈浓度从98 %降低到92 %，其保留时间分别减少。

盐浓度的选择也是影响HILIC 色谱柱保留时间的一个重要因素（见图3），研究了乙腈含量一定时，不同醋酸铵浓度（10 mmol/L～80 mmol/L）、流速：1 mL/min；检测波长为254 nm 时对几种核苷的保留时间的影响，由图3 可知，分析得可能是由于高盐浓度的增加导致固定相之间静电斥力的增加[10]，从而随着盐浓度的增加，核苷的保留时间逐渐缩短。

图3 盐浓度对保留时间的影响Fig.3 Effect of salt concentration on retention time

2.3 稳定性及重现性试验

用该色谱柱分离样品运行200 h，发现柱效、分离度等没有较明显改变，说明该色谱填料具有良好的稳定性。

3 结论

采用ATRP 技术，将乙烯基咪唑成功的接枝到了自制的粒径为7.0 μm 大孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂上，得到了一种亲水性良好的聚乙烯基咪唑色谱柱，对该固定相进行元素分析，红外光谱等进行了表征。制备的聚乙烯基咪唑色谱柱固定相可以成功分离核苷类化合物，并且该色谱柱具有良好的重现性和稳定性。

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