基于高通量测序解析UHT 灭菌乳品质劣变关联微生物

娄梦雪，贺凯茹，韩琦，刘晓燕，朴瑜琼，刘至立，臧健，武俊瑞,3

（1.沈阳农业大学食品学院，沈阳 110866；2.辽宁省食品发酵技术工程研究中心，沈阳 110161；3.沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室，沈阳 110866；4.沈阳农业大学分析测试中心，沈阳 110866）

0 引言

超高温灭菌（ultra-high temperature treated，UHT）乳因具有品质高、方便饮用等特点而在我国乳品行业广受欢迎，现已成为人们日常饮食中的重要角色[1]。目前UHT 乳货架期虽然能够延长至6 个月以上，但是某些环节控制不当仍会造成UHT 乳在货架期内出现一些质量问题，如脂肪上浮、凝块、变味、褐变、坏包等[2]，影响产品价值甚至危害人体健康。

在超高温灭菌乳的长期储存期间，影响其口感和感官质量的主要过程是蛋白质分解、脂肪分解、氧化和美拉德反应[3]。Caldera 等研究了来自不同食品的66 个假单胞菌菌株的酶解腐败活性，发现在UHT 乳中测得的蛋白质分解活性变化很大[4]。UHT 乳中残留的微生物也与乳品质密切相关，黄卫强等[5]采用16S rDNA高通量测序技术比较了2 个不同品牌UHT 乳中的微生物多样性，通过对两份UHT 牛乳样品进行高通量测序分析发现，两份UHT 牛乳中的生物多样性丰度存在一定的差异，但差异不显著。张敏等[6]应用高通量测序技术分析了新疆2 地区的7 种乳制品，结果表明，牛奶的优势菌门是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes），优势菌属是假单胞杆菌属（Pseudomonas）。目前，高通量测序技术已经广泛用于分析生乳及巴氏杀菌乳中微生物群落组成，并用于确定有益和有害细菌的存在[7]，但研究品质正常UHT 乳与品质劣变UHT 乳的微生物多样性差异的研究较少。

本研究以某大型乳品企业采集的9 份在货架期内品质劣变和正常质量的UHT 乳为研究对象，通过高通量测序和生物信息学等技术方法研究样品乳在质量特征、微生物群谱方面的差异及两者之间的相关性，为探索品质劣变问题产生的原因提供新的见解，并分析与UHT 乳品质劣变等质量问题相关的核心微生物群。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

UHT 乳来自于同一品牌的某大型乳企。产地1、产地2、产地3 按照相同的工艺生产，每个产地分别采集3 个批次的样品进行检测分析。产地1 为正常产品乳（SZ1、SZ2、SZ3）、产地2（WY1、WY2、WY3）和产地3（QY1、QY2、QY3）在货架期内观察到品质劣变现象，样品形态如图1 所示。

图1 样品形态

DNA 提取试剂盒，上海美吉生物有限公司；脂肪酶（LPS）活性检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ALC-1100.2H-2050R 型超速冷冻离心机，湖南湘仪公司；2720 型PCR 扩增仪，南京贝登电子商务有限公司；DYY-6C 型电泳仪，济宁市翰业机械设备有限公司；凝胶成像系统，上海勤翔科学仪器有限公司；电子pH 计，湖南湘仪公司；Mastersizer 2000 纳米粒径电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；120 乳品综合成分指标分析仪，山东国康电子科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色差的测定

采用pH 计和色差仪测定9 份样品pH 值及色泽，确定其亮度值（L*）、红绿值（a*）、黄蓝值（b*）。样品中的蛋白质、脂肪、非乳脂固体和乳糖采用乳品综合成分指标分析仪进行测定。每个样品都进行3 次平行测试。

1.3.2 酒精阳性乳的测定

9 份样品分别取5 mL，加入5 mL 70 %的酒精。若牛乳产生微细颗粒或絮状凝块，则可判定为酒精阳性乳。反之，则是非阳性乳。试验重复3 次。

1.3.3 Zeta 电位的测定

9 份样品分别取适当体积于烧杯中，去离子水稀释1 000 倍，用0.45 μm 的微孔滤膜过滤后使用纳米粒径电位分析仪进行3 次重复测定，取平均值。

1.3.4 蛋白酶活性的测定

通过福林酚法测定样品中的蛋白酶活性。具体步骤参见杨旭等[8]研究。UHT 乳中蛋白酶活力为：

X=AKL/T

式中：X 为样品的蛋白酶活力（U/mL）；A 为样品的吸光度；K 为吸光常数；L 为反应试剂的总体积；T为反应时间。

1.3.5 脂肪酶活性的测定

使用脂肪酶活性检测试剂盒测定脂肪酶活力。计算公式：

酶活力=x/Tm

式中：x 为吸光度；T 为催化反应时间；m 为发酵液稀释倍数。

1.3.6 微生物学检测

1.3.6.1 基因组DNA 提取

将20 mL UHT 乳置于20 mL 的离心管中。离心后去除乳脂层，再12 000 g 离心20 min 收集菌体沉淀。使用DNA 提取试剂盒提取UHT 乳样品中的细菌DNA，并利用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.6.2 PCR 扩增

采用细菌338F 和806R 通用引物对16S rDNA的V3～V4 可变区进行扩增，PCR 产物利用2 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.6.3 荧光定量电泳及Miseq 文库构建

将PCR 产物用荧光定量系统进行检测定量，根据每个样品的测序量进行相应比例的混合后，最后采用Illumina 系统进行文库构建并测序。

1.4 数据分析

数据采用SPSS 软件进行处理，P＜0.05 为差异显著。利用Majorbio 云平台（www.majorbio.com）将样本的序列数据进行分离，以97 %相似度区分有效OTU数目。基于OTU 聚类分析结果，通过alpha 多样性指数反映微生物群落的丰富度和多样性，包括一系列统计学分析指数Sobs 和Shannon。同时在OTU 水平上进行beta 多样性分析。基于分类学信息，在门和属分类水平上进行群落结构的统计分析，对样本的群落组成进行一系列深入的统计学和可视化分析。最后进行相关的热力图分析。

2 结果与讨论

2.1 UHT 乳样品的质量特性分析

2.1.1 色差值的测定结果

利用色差仪对9 份样品的颜色进行检测分析。其中L*值表示亮度，L*值越大，代表样品越亮。由图2可知，与正常UHT 乳SZ 相比，WY 和QY2 亮度均显著性升高（P＜0.05），QY1 和QY3 亮度显著降低。牛乳的L*值与牛乳的成分组成有关，光线的聚集程度决定牛乳的亮度，酪蛋白和脂肪球的分散则会对其造成影响[9]。由图3、图4 可知，品质劣变UHT 乳的a* 和b*值与正常UHT 乳的a*和b*值有统计学差异（P＜0.05）。品质劣变UHT 乳的a*绝对值明显下降，而b*值明显上升，说明品质劣变UHT 乳WY 和QY 在颜色上都发生了较大变化，并向黄褐色转变，如图1。一些研究表明，b*值的增加与美拉德反应有关，它导致了牛乳颜色的变化[10]。

图2 亮度值测定结果

图3 红绿值测定结果

图4 黄蓝值测定结果

2.1.2 pH 值测定结果

由图5 可知，样品的pH 值为6.53～6.78 之间，处于正常乳所要求的pH 值（6.4～6.8）区域内，即样品均符合标准。品质劣变UHT 乳与正常UHT 乳相比有统计学差异（P＜0.05），pH 值都在一定程度上呈现下降趋势。Devi 等[11]也发现液态配方奶储存期间pH 值呈下降趋势，推测是因为脂肪与氧气接触产生游离脂肪酸，从而使pH 值下降。

图5 样品的pH 值测定结果

2.1.3 营养成分测定结果

通过乳品成分分析仪对UHT 乳中常规营养成分进行检测，结果如图6 所示。从图6 可以看出，品质劣变乳的基础营养物质含量与正常UHT 乳相比，变化不显著。品质劣变乳的蛋白质和脂肪含量略有下降，推测是乳中存在尚具有一定活性的嗜冷菌能够产生耐热酶类物质，从而分解蛋白质和脂肪，最终影响UHT 乳品质。

图6 常规营养成分测定结果

2.1.4 酒精阳性乳测定结果

将70%酒精与9 份样品1∶1 混合，出现沉淀即为酒精阳性乳。由表1 可知，品质劣变乳WY 和QY2 均出现酒精阳性乳现象。酒精阳性乳试验是检验蛋白质稳定性的重要指标，目前使用酒精试验主要目的是检测牛乳中蛋白质的热稳定性，而牛乳中的蛋白质85%为酪蛋白。有研究表明，阳性结果的絮状沉淀物就是酪蛋白胶束的凝集物[12]，因此酪蛋白含量改变可能是引起品质劣变产品乳产生酒精阳性乳现象的原因。

表1 9 份样品乳的酒精阳性乳结果

2.1.5 Zeta 电位测定结果

表征牛乳体系稳定性的指标之一就是Zeta 电位，牛乳的体系稳定性与Zeta 电位的绝对值呈正相关。由图7 可知，所有样品的Zeta 电位值均为负数，且与正常UHT 乳相比，品质劣变乳WY1、WY2、WY3 和QY2 样品的Zeta 电位绝对值较低，与正常产品乳具有统计学差异（P＜0.05）。推测品质劣变UHT 乳Zeta电位绝对值降低，体系稳定性下降的原因是牛乳中乳糖分解产生乳酸，使得乳的酸度增加，从而导致体系电位不稳定。

图7 Zeta 电位测定结果

2.1.6 蛋白酶活性测定结果

样品中的蛋白酶活性通过福林酚法测定，结果如表2。品质劣变UHT 乳WY 与QY2 的蛋白酶活性显著高于正常产品乳SZ（P＜0.05）。这表明品质劣变产品乳出现的原因可能与乳中残留的耐热蛋白酶相关，乳中的一些嗜冷菌会产生耐热蛋白酶，耐热酶经UHT杀菌处理并不能完全失活，而未失活的耐热酶在货架期内分解乳蛋白质，从而造成蛋白沉淀现象。

表2 蛋白酶活性的测定

2.1.7 脂肪酶活性测定结果

脂肪酶活性由脂肪酶活性检测试剂盒进行测定，结果如表3。品质劣变乳WY 和QY2 与正常产品乳相比不具有显著差异（P＞0.05），而品质劣变乳QY1 和QY3 的脂肪酶活性显著升高（P＜0.05）。这可能是由于嗜热菌产生的耐高温脂肪酶分解了牛乳脂肪球膜，并聚集成大分子脂肪球，导致UHT 乳在货架期内出现脂肪上浮和脂肪氧化等异常现象。

表3 脂肪酶活性测定结果

2.2 UHT 乳微生物学检测结果

2.2.1 细菌PCR 扩增结果

PCR 产物经2 %琼脂糖凝胶电泳检测，检测的电泳图如图8 所示。

图8 8 份样品乳的PCR 扩增电泳

由图8 可知，8 份UHT 乳样品细菌16S V3-V4区在750 bp 处扩增条带明显，可进行后续试验。此外，SZ3 样品DNA 提取未成功。

2.2.2 细菌的稀释曲线

从每个样本中随机抽取一定数量的序列，统计该序列所代表的OTU 数目，从而判断样本测序数据的合理性。由图9 可知，当样品细菌菌落测序碱基量较小时，OTU 数目随着测序碱基量呈抛物线增长趋势迅速增加，当测序量达到400 左右时，稀释曲线总体趋势增长缓慢并趋于平缓，说明测序数据量合理，序列数基本可以反映出每组样品中的菌群结构，满足了后续生物信息学分析的要求。

图9 Alpha 多样性指数稀释

2.2.3 Alpha 多样性指数分析

Alpha 多样性指数与种类数目和个体均匀性有关，可以直接反映样品的丰富度和均匀度。Shannon 指数反映微生物群落多样性，Sobs 指数反映群落丰富度。由图10 可知，与正常产品乳相比，品质劣变乳Shannon 指数显著降低，表明品质劣变乳中微生物多样性降低，其中WY3 样品其Shannon 指数最小，该样品中菌群的多样性最低。由图11 可知，与正常产品乳相比，品质劣变乳Sobs 指数也较低，表明品质劣变乳中菌群丰富度较低。与正常UHT 乳相比，劣变产品乳中Alpha 多样性低，可能是由于品质劣变乳中产生了某种优势菌株。同时，品质劣变乳WY 样品与品质劣变乳QY 样品相比，Shannon 指数和Sobs 指数更低，微生物群落的丰富度及多样性都更低。

图10 Shannon 指数alpha 多样性分析

2.2.4 样本Beta 多样性指数分析

2.2.4.1 基于OTU 水平的样本层级聚类分析

为研究不同产地UHT 乳样本群落结构的相似度或差异性，利用聚类方法建立了样本层次聚类树，如图12 所示，结果表明，产地2 品质劣变乳WY 样品可聚为一个分支，说明产地2 样品组间差异较小。产地3品质劣变乳与产地1 正常产品乳SZ1 和SZ2 可聚为一个分支，说明产地3 品质劣变乳与正常产品乳物种间群落结构相似，从样品形态图中也可以看出产地3品质劣变乳要优于产地2，推测产地3 出现品质劣变时间尚短，物种间群落结构还未发生较大变化，因此会与正常产品乳聚为一个分支。

图12 8 份样品的层级聚类分析

2.2.4.2 基于OTU 水平的PCA 分析

图13 为不同产地UHT 乳OTU 水平的PCA 分析图。PCA 的两个成分（F1 和F2）解释了总方差的98.03%，F1 和F2 分别解释了92.35%和5.68%。根据OTU 水平的PCA 聚类分析，劣变乳WY 聚类在一起，组内样本点分布较聚集，与层次聚类分析结果相似。同时，品质劣变乳WY 与正常产品乳SZ1 和SZ2间距离较远，说明样品间微生物群落结构差异较大。而品质劣变乳QY 与正常产品乳SZ1 间距离较近，微生物群落结构相似；与SZ2 距离较远，微生物群落结构有较大差异。

图13 样品乳的PCA 分析

2.2.5 门水平的细菌群落结构组成

将测序所得序列与数据库进行比对，解析UHT乳中具体微生物组成，门水平相对丰度分析如图14所示，结果表明，UHT 乳样品中主要菌群为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）；这和黄卫强等研究发现UHT 乳基于门水平的微生物结构组成的结果相似[5]。我们的研究结果确定了主要的4 个细菌门，主导着UHT 乳的微生物群落。品质劣变乳与正常UHT 乳在门水平组成上相似，各样品间的优势菌门基本相同，但相对丰度存在一定的差异。8 个UHT 乳样品的优势菌门均为变形菌门（Proteobacteria），含量约为90 %以上，其中SZ2 中变形菌门（Proteobacteria）含量稍低，约为81 %。此外，品质劣变乳中，产地2 的WY样品与QY2 样品组成及含量上接近；QY1 与QY3 中变形菌门（Proteobacteria）含量相较于QY2 和产地2 样品低一些，但厚壁菌门（Firmicutes）含量稍高。

图14 8 份样品门水平上的细菌群落结构组成

2.2.6 属水平的细菌群落结构组成

由于16S 测序结果在属水平上最为准确，所以将门水平结果进一步整理，对属分类水平进行鉴定，得到结果如图15 所示。

图15 8 份样品属水平上的细菌群落结构组成

由图15 可知，在属水平上，戴尔福特菌属在各个UHT 乳样品中占比超过61%以上，为各个样品的优势菌属，这与唐振华[13]检测水牛乳属水平细菌多样性的研究结果相同。品质劣变乳WY 样品中微生物多样性相对较低，群落组成高度集中在戴尔福特菌属上，约91%以上为戴尔福特菌属。而正常UHT 乳的微生物群落均匀性相对较高，戴尔福特菌属占比为73.54%、61.73%，不动杆菌属占比为15.26%、15.09%。品质劣变乳WY 样品与正常UHT 乳样品间属分类水平差异较大。同时，与正常UHT 乳相比，品质劣变乳QY 样品在属水平的微生物组成上差异较小；QY 样品戴尔福特菌属占比为82.22%、75.53%和70.30%，不动杆菌属占比为8.16%、19.93%和16.49%。

Douglas 等[14]在提取母乳微生物组DNA 方法的研究中发现，戴尔福特菌属（Delftia）为乳16S rDNA测序检测中常检出的微生物。此外，戴尔福特菌广泛分布于环境中，从污染土壤和废水中均可检出[15-16]。因此推测戴尔福特菌的高丰度出现的原因有两种，一种是戴尔福特菌为低生物量样本中的试剂污染物，来源于提取试剂盒，另一种是原料乳被牧场环境中的灰尘水体等污染，从而导致戴尔福特菌的存在。为了排查其他可能导致UHT 乳品质劣变的微生物的存在，对UHT 乳中其他低丰度细菌进行进一步分析，结果如图16。

图16 8 份样品属水平上的细菌群落结构组成（除戴尔福特菌属外）

与正常UHT 乳相比，品质劣变乳WY 样品中优势菌属为假单胞菌属（Pseudomonas），为正常UHT 乳样品的5～10 倍。此外，品质劣变乳QY 样品也检测出假单胞菌属，与正常UHT 乳样品间丰度差异较小。研究表明，假单胞菌属为乳中常见嗜冷菌，能够分泌耐热蛋白酶和脂肪酶[17]，UHT 处理后仍保持一定的酶活性，会导致乳品产生苦味甚至腐败变质[7]。品质劣变乳QY 样品和正常UHT 乳样品SZ1 和SZ2 的优势菌属均为不动杆菌属（Acinetobacter），为乳中常见的嗜冷菌属，低温保藏下也能生长，并产生耐热脂肪酶，造成脂肪上浮现象[18]，其中QY2 样品中不动杆菌属丰度较高，约为正常UHT 样品的1.6 倍。此外，链球菌（Streptococcus）也是主要菌属，在正常UHT 乳样品中丰度相似。

同时，以OTU 水平将品质劣变乳与正常UHT乳进行对比分析，对品质劣变乳中特有的部分微生物进行提炼，结果如表4 所示。

表4 品质劣变乳中特有的部分微生物

与产地1 正常UHT 乳中微生物属种相比，选出产地2 和产地3 品质劣变乳中差异明显的特有微生物菌属共23 种。产地2 劣变产品乳中特有的斯诺德格拉斯菌属（Snodgrassella）、吉列姆菌属（Gilliamella）、Bombiscardovia 和孢子菌属（Sporacetigenium）均为蜜蜂肠道中的常见菌种或蜜蜂共生细菌[19-20]，推测产地2 品质劣变乳可能受到昆虫污染。产地3 品质劣变乳中，沙雷氏菌属（Serratia）和厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）为特有菌属；沙雷氏菌属为乳中常见嗜冷菌和致病菌，其胞外酶可以水解脂肪和蛋白质[21-22]；而厌氧芽孢杆菌属则是乳品工厂的废水中常检测到的优势菌[23]。

2.3 与品质劣变UHT 乳的质量特性相关的核心微生物群

2.3.1 UHT 乳中微生物群落组成和理化特性之间的相关性

利用相关热图分析了UHT 奶中微生物群落组成和理化特性之间的相关性，如图17。结果显示，样品的脂肪和蛋白质含量与微生物细菌群落有明显的相关性（P＜0.05）。一些细菌，如吉列姆菌（Gilliamella）、拉尔斯通尼亚菌（Ralstonia）和嗜酸菌（Acidovorax），与乳糖、脂肪和蛋白质的丰度表现出显著的正相关关系。此外，假单胞菌（WY 样品）、链球菌和不动杆菌（QY 样品）显著参与了UHT 牛奶的多种理化性质。例如，假单胞菌与脂肪、蛋白质显示出明显的正相关关系。链球菌与L*值、Zeta 电位呈负相关。这进一步说明，微生物的功能特征促进了糖类的代谢、蛋白质的分解和重要代谢物的产生[7]。

图17 微生物与理化指标相关性热图

2.3.2 UHT 乳中微生物群落组成和酶活性之间的相关性

品质劣变UHT 乳（WY 和QY）受到耐热蛋白酶和脂肪酶的影响，我们进一步分析了牛奶中的微生物属与酶活性之间的相关性。根据结果可以看出，大多数菌属在蛋白酶和脂肪酶含量上呈现相反的趋势如图18 所示。例如，梭状芽孢杆菌（Clostridium）和拉尔斯通尼亚菌（Ralstonia）与蛋白酶含量呈显著正相关（P＜0.05），与脂肪酶含量呈负相关。此外，作为QY 样品中的核心微生物，不动杆菌与脂肪酶活性呈正相关，与蛋白酶活性呈负相关，这也与之前测定的酶活性相符。研究表明，不动杆菌属是一种常见的导致牛奶中甜凝缺陷/苦奶油的病原体[24]，是常见产耐热酶的嗜冷菌，其大量繁殖会影响乳成分，导致腐败变质。然而，假单胞菌作为WY 样品中的主要细菌属，与脂肪酶活性呈负相关，与蛋白酶呈正相关。Dina Raats 等[25]采用DGGE技术分析，结果表明，乳中的嗜冷菌占主要比例的菌群均为假单胞菌属。研究表明，假单胞菌属约占低温保存的生牛乳微生物总量的70%～90%[26]。假单胞菌属的丰度主要是受其蛋白水解酶活性和耐低温特性影响，在巴氏杀菌甚至UHT 处理后仍保持活性[27]，是造成牛奶腐败变质和货架期缩短的主要原因[28]。

图18 微生物与酶活力相关性热图

3 结论

本文探讨了同一品牌正常UHT 乳（SZ）和品质劣变UHT 乳（WY、QY）的质量特性和微生物分布，并研究了它们之间的相关性。结果表明，品质劣变UHT 乳在理化指标、酶活性和微生物群分布方面与正常UHT 乳有明显不同。并且假单胞菌和不动杆菌被确定为核心功能微生物，显著地参与并影响了UHT 乳的质量特性，这些菌产生的耐热酶类物质，能够分解蛋白质和脂肪，从而影响UHT 乳品质。此外，发现假单胞菌的丰度在品质劣变UHT 乳（WY）中明显增加，并与耐热蛋白酶含量呈明显的正相关，而品质劣变UHT 乳核心微生物不动杆菌与耐热脂肪酶活性呈正相关。但对假单胞菌、不动杆菌产酶特性和作用机制没有进行深入的研究，以及戴尔福特菌属是否也是产酶的关键菌株同样需要进行进一步的试验。