乳及乳制品中乳铁蛋白的全自动高通量毛细管凝胶电泳检测方法研究

孙娜娜，刘金虎，杨孟迪，徐丹，徐秦峰

(陕西科技大学食品与生物工程学院国家羊乳制品加工技术研发专业中心，西安710021)

0 引言

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种具有抗菌、抗病毒、增强机体免疫力等多种生物活性的铁结合糖蛋白，分子量约为80 ku[1-2]。2012年我国将乳铁蛋白列入营养强化剂[3]可添加至婴幼儿配方奶粉中，使其更成分更接近母乳，增加营养价值。相关研究表明，乳铁蛋白对婴幼儿贫血、腹泻以及降低新生儿败血症等具有重要的辅助和治疗作用[4]。大量的研究表明，热处理程度不同，乳铁蛋白的变性程度存在差异[2,5]，但为保证液态乳的安全性和质量，在生产过程中必须进行热杀菌工艺。因此，精准的热处理工艺，不仅可以保证牛乳的食用安全，同时又能最大程度地保留牛奶中的天然活性蛋白，提高牛奶的营养价值。乳铁蛋白含量作为优质巴氏杀菌乳的重要评价指标[6-7]，乳铁蛋白的准确、快速定量对优质乳的生产工艺控制以及婴幼儿奶粉营养价值评估具有重要的参考意义。

目前，常见的乳铁蛋白的检测方法有高效液相色谱法、酶联免疫法、液相色谱-质谱法、毛细管区带电泳法等[7-8]。由于乳制品中乳铁蛋白丰度较低且乳制品成分复杂，我国尚未建立乳及其制品中乳铁蛋白检测的国家标准[9]，高效液相色谱由于其高灵敏度和特异性[10-16]，作为乳铁蛋白检测最常用的方法，仅适用于乳铁蛋白含量较高的样品，团体标准T/TDSTIA 006-2019《奶及奶制品中乳铁蛋白的测定液相色谱法》用于乳制品中乳铁蛋白的定量检测，通过磷酸盐提取、肝素亲和柱富集后进行高效液相色谱法检测[17]，前处理过程繁琐且成本较高。高效液相色谱-串联质谱法，通过内标法增加了检测的准确性，但不可避免的胰蛋白酶水解寻找特异性肽段的过程时间较长且整个检测过程对操作人员的专业素养要求较高[18-21]。酶联免疫法灵敏度高但检测时需要逐级稀释确保检测结果有效所以重现性较差[22-23]。毛细管区带电泳法灵敏度高，但为抑制蛋白吸附，提高检测的准确性，需要对毛细管内壁进行涂层处理。Li Jia[24]通过添加非离子表面活性剂Brij35抑制毛细管内壁对LF的吸附作用，结合紫外检测器实现了LF的定量检测。Mao ke[25]等通过热致聚（2-甲基-2-噁唑琳）涂层实现了婴幼儿奶粉中LF的毛细管区带电泳分析。基于上述方法的优缺点，建立前处理简单、快速、准确的LF检测方法仍然是乳制品企业用于乳制品质量评估以及热处理工艺控制的不懈追求。

本研究通过筛选的适配体和LF的特异性结合，经全自动毛细管凝胶电泳分析后游离适配体的峰面积的减少以及减少程度实现乳铁蛋白的定性定量检测。避免了前期研究通过聚丙烯酰胺[26]和琼脂糖凝胶电泳[27-28]检测乳铁蛋白的制胶、点样、灰度读取等耗时、繁复的流程，相比Zhu chao[29]等建立的乳铁蛋白的毛细管区带电泳-适配体传感器检测方法，具有分析时间更短、自动化程度高的优点，为乳制品企业检测LF提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

DNA序列（5’-(FAM)-AGG CAG GAC ACC GTA ACC GGT GCA TCT ATG GCT ACT AGC TCT TCC TGC CT-3’）由上海生工生物工程公司合成，DL500 bp DNA marker（Takara），各蛋白标准品、100×TE缓冲液以及磷酸盐缓冲液PBS（Sigma-Aldrich），20 bp DNA Marker、1 000 bp DNA Marker、高分辨卡夹S1（High Resolution Cartridge）、标准卡夹S2（Standard Cartridge）以及快速卡夹F3（Fast Cartridge）均来自台湾光鼎（Bioptic）公司。

5424R高速冷冻离心机，Eppendorf有限公司；QSEP 100 Advance全自动核酸分析仪，台湾Bioptic公司；DK-8D电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司，MYSPIN 12微型离心机，Thermo Fisher Scientific；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司。

1.2 实验材料

实验中所用到的生牛乳来源学校附近散户售卖处，巴氏乳、全脂牛乳以及婴幼儿固体奶粉购于西安市某超市，液态奶样品冰箱4℃储存待用，奶粉样品常温储存待用。

1.3 检测方法

实验中的DNA序列由1×TE缓冲液溶解至100 μmol/L，1×PBS（pH为7.4时，NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO4·12H2O 10 mmol/L,KH2PO42 mmol/L）稀释至1μmol/L。为获得具有功能性的DNA序列的二级结构和三级结构，使用前对DNA序列进行95±0.5℃，5 min退火处理，冰箱-20℃下2 min冷却待用。

全自动毛细管凝胶电泳检测参数为：LED激发光源：480 nm；检测器：PMT荧光检测器；进样电压：4 k V；进样时间：10 s；分离电压：8 k V；分离时间：240 s；毛细管的有效分离长度为13 cm。

1.4 可行性验证

2.5μL乳铁蛋白（100μg/mL）、5.0μL FAM-DNA序列、2.5μL（100μg/mL）乳铁蛋白和5.0μL FAMDNA序列的混合物中分别加入1.0μL 20×PBS，加入超纯水至最终体系为20μL，混匀孵育30 min后进行全自动毛细管凝胶电泳检测和琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 毛细管凝胶电泳检测参数对实验的影响

1.5.1 进样时间对检测的影响

5.0μL FAM-DNA序列中加入2.0μL的乳铁蛋白（100μg/mL），加入1.0μL的20×PBS，加入超纯水至终体系为20μL，混匀孵育30 min。设置进样时间分别为10、15、30、45、60 s，进行全自动毛细管凝胶电泳检测。

1.5.2 卡夹类型和分离电压对检测的影响

FAM-DNA序列5.0μL中加入2.0μL的乳铁蛋白（100μg/mL），1.0μL的20×PBS，加入超纯水至终体系为20μL，混匀孵育30 min。改变分离卡夹类型以及分离电压，进行全自动毛细管凝胶电泳检测。

1.6 灵敏度检测

5.0μL FAM-DNA序列中分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μL的乳铁蛋白（100μg/mL），加入1.0μL 20×PBS后加超纯水使得最终体系为20μL，混匀孵育30 min，进行全自动毛细管凝胶电泳检测。

1.7 特异性验证

5.0μL FAM-DNA序列中分别加入2.0μL乳铁蛋白（100μg/mL）、4.0μL（100μg/mL）乳制品中常见的干扰蛋白α-乳白蛋白（α-Lac，α-lactabumin）、β-乳球蛋白（β-LG,β-lactoglobulin）、酪蛋白（Casein）以及设置空白对照（Buffer），加入1.0μL 20×PBS，加超纯水使得最终体系为20μL，混匀孵育30 min，进行全自动毛细管凝胶电泳检测。

1.8 实际样品检测

5.0μL FAM-DNA序列中分别加入巴氏乳2.0μL、全脂牛乳2.0μL、生牛乳1.0μL，婴幼儿奶粉（含乳铁蛋白）3.0μL、婴幼儿奶粉（不含乳铁蛋白）3.0μL，对于加标样品，加入1.0μL乳铁蛋白（100μg/mL），各加入1.0μL 20×PBS后加超纯水使得最终体系为20μL，混匀孵育30 min，进行全自动毛细管凝胶电泳检测（婴幼儿奶粉溶解方式为称取1 g奶粉用超纯水定容至7 mL）。

2 结果与讨论

2.1 毛细管凝胶电泳检测乳铁蛋白的可行性验证

毛细管凝胶电泳通过在电场作用下各DNA片段长度差异导致电泳迁移率不同，实现样品中的DNA片段分离，根据各DNA片段出峰时间以及分离后峰面积差异实现DNA片段的定性、定量。适配体[30]是可以高亲和力和特异性识别目标物质的一段DNA或者RNA序列，目标物质包括蛋白质、金属离子、小分子等。本研究通过许丹科[31]等筛选的乳铁蛋白Lac-A4序列适配体和LF的特异性结合，经全自动毛细管凝胶电泳分析后游离适配体的峰面积的减少实现乳铁蛋白的定性定量检测。

将LF、FAM-DNA+LF以及FAM-DNA样品在结合缓冲液中孵育后使用标准卡夹（S2，8 kV）进行全自动毛细管凝胶电泳检测，验证方法的可行性。结果如图1（a）所示，FAM-DNA+LF、FAM-DNA样品均在61 s处出现DNA序列的峰，由于FAM-DNA和乳铁蛋白的特异性结合，导致含乳铁蛋白的阳性样品游离DNA的信号和峰面积大小明显低于不含乳铁蛋白的阴性样品，单独的LF样品未观察到明显的电泳信号。图1（b）琼脂糖凝胶电泳的结果表明DNA序列确实能和LF发生特异性结合，生成滞后的DNA-LF复合物条带，导致未结合的DNA序列灰度值降低，验证了本研究通过全自动毛细管凝胶电泳利用FAM-DNA序列和乳铁蛋白的特异性结合，导致峰面积减少对乳铁蛋白进行定性定量检测的可行性。

图1 全自动凝胶电泳检测乳铁蛋白的可行性验证

全自动毛细管凝胶电泳结果未能观察到DNA和LF结合的复合物峰，可能是由于LF分子量较大，全自动毛细管凝胶电泳采用电动进样，存在进样歧视，样品的进样时间太短导致LF-DNA复合物未能进入检测，所以未出现LF-DNA复合物的峰。因此通过增加进样时间观察能否出现复合物的峰。结果如表1所示，随着进样时间的增加，样品的进样量增加，游离DNA的峰面积增加，但未能发现复合物的峰。

表1 进样时间对检测结果的影响

不同类型的卡夹的最佳分辨率和分离电压不同，电泳缓冲液也可能不同。猜测上述卡夹类型和分离电压导致未能发现复合物的峰，因此选用Bioptic公司中常见的高分辨率卡夹（S1，6 k V）、标准卡夹（S2，8 k V和10 k V）以及快速卡夹（F3，13 k V）分别对含乳铁蛋白的阳性样品进行毛细管凝胶电泳检测，结果如表2所示。改变不同的卡夹和分离电压，均在靠近20 bp DNA Marker附近发现游离DNA的峰。但仍未能发现LF-DNA复合物的峰。

表2 分离卡夹以及分离电压对检测结果的影响

上述的研究表明通过改变进样时间、卡夹类型和分离电压，均未能指示LF-DNA复合物的峰。通过查阅毛细管凝胶电泳分析DNA和蛋白质相互作用的相关文献，Hu Jiaming等[32]利用游离适配体DNA电泳峰面积的减少对适配体DNA的解离常数进行测定，此文献中强调了采用的是非变性凝胶，因此推测实验中未能观察到复合物电泳峰，最大的可能是所用的卡夹凝胶中包含变性剂(卡夹中分离凝胶缓冲液详细信息未知)，影响蛋白质进入毛细管，从而影响复合物出峰。而图1（b）琼脂糖凝胶电泳能清晰的观察到LF-DNA复合物的峰，主要是因为凝胶和电泳缓冲液中不包含变性剂，而且凝胶本身也对DNA-蛋白质的结合有稳定作用[33]。再者，Hu Jiaming[32]等人通过对凝血酶和DNA适配体的全自动毛细管相互作用的研究表明，采用游离DNA峰面积的减少进行定量检测时误差更少，因此本实验可以根据不同浓度的乳铁蛋白和DNA结合后，游离DNA的峰面积变化对乳铁蛋白进行定量。

2.2 灵敏度实验

为了验证所建立的全自动高通量毛细管凝胶电泳方法可以用于乳及其制品中乳铁蛋白的定量检测，将浓度梯度的乳铁蛋白标准品分别和FAM-DNA序列孵育，结合缓冲液做空白对照，使用标准卡夹（S2，8 k V）进行全自动毛细管凝胶电泳检测，随着乳铁蛋白的增加，导致更多的乳铁蛋白和FAM-DNA发生特异性结合，因此游离的DNA序列减少，产生的峰面积降低如图2（a）所示。

以乳铁蛋白的浓度（nmol/L）为横坐标，游离DNA序列的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为y=-21.6784x+10735.16667，R2=0.96051，如图2（b）。结果表明该方法可以用于乳铁蛋白的定量检测并且呈现良好的线性关系。

图2 不同浓度乳铁蛋白的全自动毛细管凝胶电泳图及标准曲线图

2.3 特异性验证

为排除乳及其制品中常见的干扰蛋白如α-乳白蛋白（α-Lac）、β-乳球蛋白（β-LG）、酪蛋白（Cas）和FAM-DNA序列的非特异性结合，影响对乳铁蛋白（LF）检测的准确性。将FAM-DNA序列和不同蛋白孵育后，使用标准卡夹（S2，8 k V）进行毛细管凝胶电泳检测。结果如图3所示：只有含LF的样品和DNA特异性结合使得游离DNA的峰面积明显减少，表明只有乳铁蛋白和FAM-DNA序列发生了特异性结合，导致游离DNA峰面积减少。因此可以通过毛细管凝胶电泳后游离DNA峰面积的减少，实现乳铁蛋白的特异性检测。

图3 全自动毛细管凝胶电泳检测乳铁蛋白的特异性

2.4 实际样品检测

为验证本研究建立的全自动毛细管凝胶电泳法检测乳铁蛋白的实用性，采用上述方法对市售的5种乳及其制品（生牛乳、全脂牛乳、巴氏杀菌乳、不含乳铁蛋白的婴幼儿奶粉、含乳铁蛋白的婴幼儿奶粉）中乳铁蛋白含量进行检测。检测结果如表3所示。阳性奶粉检测值为27.7 mg/100 g(标示值为30 mg/100 g)，与标签值接近且加标回收率为97.8%，阴性奶粉样品未检出。生牛乳中乳铁蛋白的检测量在0.02～0.35 mg/mL[34]范围内且高于巴氏乳和全脂牛乳，与预期相符。表明本研究建立的毛细管凝胶电泳操作简单、全自动即可用于乳及其制品中乳铁蛋白的定量检测。为企业优质乳的生产工艺控制以及婴幼儿奶粉营养价值评价提供一定的技术参考。

表3 实际样品中乳铁蛋白的检测结果

3 结论

乳铁蛋白作为营养强化剂添加到许多婴幼儿奶粉中提高婴幼儿奶粉的营养价值；乳铁蛋白的含量作为优质巴氏杀菌乳的重要评价指标。因此建立乳及乳制品中乳铁蛋白的简便快速、低成本、高通量的检测方法十分重要，其不仅可以对液态乳的生产工艺进行精准控制，也可对婴幼儿奶粉的营养价值进行评估。本研究利用DNA序列和LF的特异性结合，基于游离DNA序列的峰面积大小和乳铁蛋白的浓度呈现的良好线性关系建立了一种操作简单、快速、准确的乳及其制品中乳铁蛋白的全自动毛细管凝胶电泳定性定量检测方法。采用预制胶卡夹避免毛细管区带电泳需要涂层抑制非特异性吸附的困境，也无需传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳繁琐的制胶、点样、灰度读取等过程。对液态乳生产加工工艺控制以及婴幼儿奶粉营养评估提供技术支持。