QuEChERS净化-高效液相色谱串联质谱法快速筛查乳制品中10种喹诺酮类抗生素

李磊，周贻兵，张权，林野，李海畅，郭华

（1.贵州省疾病预防控制中心实验中心理化科，贵阳550001；2.贵阳市疾病预防控制中心理化科，贵阳550001）

0 引言

喹诺酮类抗生素是一类人工合成的广谱抗菌药，由于容易获得且价格较低而被广泛应用于畜牧业养殖生产[1]。近年来随着喹诺酮类抗生素在动物养殖业中的大量使用，动物源性食品中出现喹诺酮类药物残留的风险日趋增加[2]。长期食用喹诺酮类抗生素超标的食物会影响儿童骨骼发育并产生皮肤及神经毒性[3-5]，相关研究显示乳制品中喹诺酮抗生素主要来源于对泌乳期奶牛的不合理用药[6]及防止乳制品变质而特意添加[7]。目前，美国、欧盟、日本都对喹诺酮类药物制定了最大残留限量[8]，我国也对恩诺沙星、达氟沙星等喹诺酮类抗生素做出了限量规定[9]。因此有必要建立乳制品中的喹诺酮残留量筛查方法。

喹诺酮类药物的主要检测方法有薄层色谱法[10]，酶联免疫法[11-13]，高效液相色谱法[14-15]及液相色谱串联质谱法[16-19]，而前处理技术主要包括固相萃取净化[16-19]及QuEChERS净化技术[8，20]，经典的固相萃取方法虽然重现性稳定，但操作繁琐，对操作人员能力要求较高[21]，而QuEChERS方法操作简便，前处理过程简单[22-25]，更适合快速筛查工作。而目前已有报道的乳制品中QuEChERS净化方法主要以碳18（C18）作为主要净化材料[8]，但C18净化难以去除乳制品中脂类基质，影响方法回收率表现。该研究以改良型QuECh-ERS净化并采用高通量的液相色谱串联质谱技术进行乳制品中喹诺酮筛查，通过特定净化填料除去乳制品中脂肪基质并使用乙腈沉淀蛋白，该方法能够在获得稳定分析结果的同时简化操作流程，适用于乳制品中喹诺酮类化合物的快速筛查工作。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星、达氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、西诺沙星标准品，德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），美国飞世尔试剂公司；试剂净化包（EMR QuEChERS），安捷伦科技有限公司；采集市售巴氏灭菌鲜奶及原味酸奶各5个批次作为测试样品。

1.2 仪器与设备

U 3000型超高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔公司；TSQ Quantum型三重四极杆质谱仪，美国赛默飞世尔公司；3-30KS型高速离心机，德国赛多利斯公司；Milli-Q型超纯水机，美国密理博公司。

1.3 样品前处理方法

取5.0 g乳制品样品于15 mL离心管中，加入EMR QuEChERS净化填料后加入5 mL乙腈旋涡混匀5 min，室温下7 000 r/min离心10 min。将上清液转移至含有3 g无水硫酸镁，2 g氯化钠的15 mL离心管中，震荡混匀后7 000 r/min离心10 min，取上层乙腈层2.0 mL经氮气吹干后，用流动性初始比例定容至2.0 mL，经10 000 r/min离心5 min后转移至进样小瓶中进行检测。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil Gold，2.1 mm×200 mm，1.9μm；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：甲醇-乙腈混合溶液（40∶60，v/v）；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；进样量10μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件

离子源模式：电喷雾离子源正离子模式（ESI+）；仪器参数：喷雾电压为3 500 V，离子源温度为320℃，脱溶剂温度为300℃，辅助气（N2）10 psi，鞘气（N2）34psi；采集模式：多反应监测MRM模式，化合物质谱参数见表2。

表2 质谱参数

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

质谱多组分检测中常出现离子共流出现象而导致定量结果偏差，而喹诺酮类化合物由于具有相似的母核结构，较难进行色谱行为分离导致共流出现象影响定量结果。因此需要建立合理的色谱条件来避免具有相近碎片离子的分析化合物间的共流出。本研究通分别优化甲醇、乙腈及甲醇乙腈不同比例混合溶液的色谱分离条件，在使Hypersil Gold色谱柱（200 mm×2.1 mm，1.9μm）时，0.1%甲酸水溶液-乙腈流动相分离效果差，表现为依诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星等无法获得满意的分离度，推测原因为乙腈洗脱能力过强而导致分离效果较差。为改善乙腈洗脱能力在有机相中加入甲醇，可降乙腈洗脱能力，但在改为0.1%甲酸水溶液-甲醇流动相后，出现沙拉沙星、氧氟沙星等化合物响应值降低现象。通过调整有机相甲醇乙腈比例后，发现0.1%甲酸水溶液-甲醇-乙腈混合溶液（40∶60，v/v）流动相能获得洗脱效果与化合物相应强度的平衡，获得10种喹诺酮类化合物的较好分离结果，有效的避免了具有相近碎片离子化合物的共流出对定量的干扰（图1）。

图1 10种喹诺酮类抗生素色谱图

2.2 不同净化方法对比

在现有的报道中，对于乳制品中喹诺酮检测的净化方式多采用以亲水亲脂平衡型固相萃取小柱来完成对样品的净化[16-19]，而已有的QuEChERS方法对乳制品中喹诺酮净化方法的研究多限于使用C18材料来进行净化[8]，难以去除油脂类基质干扰。本研究采用EMR QuEChERS填料对乳制品中喹诺酮进行净化，相对于固相萃取净化方法可以快速的完成样品净化操作，比使用C18净化有更为理想的油脂基质去除效率。本研究通过向经测试的空白牛奶样品中加入20.0μg/kg的喹诺酮混标，使用亲水亲脂平衡型固相萃取小柱与QuEChERS方法进行不同净化方法比较，测定结果显示亲水亲脂平衡型固相萃取小柱加标回收率在67.3%～82.1%间，方法精密度范围为5.43%～12.57%，本方法的QuEChERS净化方法回收率在72.3%～93.3%间，方法精密度范围为5.80%～10.88%。由结果可见，QuEChERS净化方法在氧氟沙星及西诺沙星中获得了优于固相萃取净化的回收率，其余喹诺酮类化合物两种净化方法的回收率相当，但QuECh-ERS净化方法更易操作，适合快速筛查检测。

表3 不同前处理方法加标回收率结果（n=6）

2.3 方法线性范围及检出限与定量限

将喹诺酮混合标准溶液使用流动性初始比例配置标准曲线，以峰面积对浓度（μg/L）绘制标准曲线。以响应值3倍信噪比（S/N）时所对应质量浓度（μg/kg）为检出限，10倍信噪比（S/N）时所对应的质量浓度（μg/kg）作为定量限，线性回归方程、检出限和定量限见表4。

表4 方法线性回归方程与检出限、定量限

2.4 方法准确度与精密度

将经过空白测试的牛奶样品加入低、中、高3个浓度组喹诺酮混标进行加标回收率实验，每个浓度组6组平行样，以1.3所述样品前处理方法进行前处理后上机进行测定。根据加标量及测定结果计算方法加标回收率范围及精密度范围。结果显示在10.0，50.0，100.0μg/kg加标浓度下，方法加标回收率范围在63.2～96.7%之间，方法精密度范围为4.32～11.42%之间。

2.5 样品检测

随机抽取市售鲜牛奶样品5个批次、酸奶5个批次使用上述方法进行前处理后检测，均未检出上述10种喹诺酮类抗生素。检测结果见表6。

表6 市售巴氏灭菌鲜奶及原味酸奶测定结果

3 结论

本研究建立了乳制品中10种喹诺酮类抗生素的QuEChERS净化-超高效液相色谱串联质谱快速筛查方法。通过EMR QuEChERS进行乳制品样品净化具有前处理简单、快速的特点，10中喹诺酮化合物在5.0～150μg/L范围内具有良好线性关系，方法检出限为1.0μg/kg，定量限为3.0μg/kg。在10.0，50.0，100.0μg/kg加标浓度下，加标回收率范围在63.2～96.7%之间，精密度范围为4.32%～11.42%之间，方法灵敏度及精密度良好，能够满足乳制品中10种喹诺酮类抗生素的快速筛查需求。

表5 方法的回收率和精密度（n=6）