牛MMP9启动子与转录因子NF-κB作用的研究

苏晨，毛永尽，杨慧琳，曲波，赵锋，崔英俊

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

0 引 言

乳腺发育是一个动态过程，其形态结构和生理功能会随机体发育在细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）精细调控下而周期性重塑[1]。乳腺的发育过程包括胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期。乳腺发育开始于胚胎期，青春期完成导管的分化和延伸，妊娠期形成分泌性腺泡，泌乳早期乳腺实质与乳腺上皮细胞持续增殖，最后退化期乳腺退化，细胞凋亡，腺泡导管塌陷，乳腺恢复成简单导管结构[2-3]。腺体经历重塑恢复至妊娠前的状态，完成一个周期，从而影响奶牛泌乳。基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMP）是基质上皮界面上主要的细胞外蛋白酶，其中基质金属蛋白酶9（Matrix Metalloproteinases 9，MMP9）被认为是乳腺周期性重塑的关键酶[4]。MMP9（明胶酶-b）是一种IV型胶原酶[4]，可由乳腺上皮细胞，基质成纤维细胞和浸润的免疫/炎症细胞表达[5-7]。MMP9在形态发生、伤口愈合[8]、组织修复和重塑、细胞生长、炎症反应[1,9]、肿瘤细胞的侵袭转移和血管生成[10-13]等生理过程中发挥重要作用。核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一个转录因子家族，可调节生长因子，细胞因子，趋化因子，黏附分子和凋亡抑制剂的表达[14-15]。在受到外界刺激时，NF-κB两个亚基（P65或P50）活化，从细胞质基质转位到胞核，并与NF-κB反应基因启动子区域的κB位点相结合，从而启动基因转录[16]。已有研究表明，在人乳腺癌细胞和结直肠癌细胞中MMP9表达受NF-κB信号通路调控[17-18]。但在牛乳腺上皮细胞中MMP9表达是否也受NF-κB信号通路调控还需确认。本研究旨在确认牛MM P9启动子与转录因子NF-κB的相互作用，为改善奶牛牛奶品质提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验室保存的牛乳腺上皮细胞和Hela细胞；实验室保存的p RL-TK、pGL3-Basic、p GL3-CMV和P65过表达质粒；胎牛血清，BI；DMEM-F12培养液，Gibco；lipofectamineTM2000，Thermo Scientific；Kpn I和Bgl II限制性内切酶，Takara；T 4连接酶，Takara；Celastrol、RIPA裂解液，索莱宝；Dual-Luciferase Reporter Assay System，Promega；Endo-free Plasmid MiniKit II，Omega；SDS-PAGE配胶试剂盒，碧云天；VE-108B垂直电泳槽，Tanon；VE 186转移电泳槽，Tanon；EPS300电泳仪，Tanon；Sag Capture，天能；Dual-Luciferase报告基因检测系统，Promega。

1.2 研究方法

1.2.1 牛MMP9启动子双荧光素酶报告载体的构建

从奶牛乳腺组织中提取DNA，在NCBI数据库中查找牛MMP9基因启动子序列。使用JASPAR、hTFtarget数据库预测转录因子P65（NF-κB的一个亚基）与MMP9启动子结合位点。设计引物，如表1所示，进行PCR扩增，获得4条逐级缩短的启动子片段。PCR产物通过凝胶电泳回收并纯化，与p GL3载体质粒分别使用Kpn I和Bgl II进行双酶切，连接、转化并测序。测序成功后的MMP9启动子双荧光素酶报告载体经扩大培养，提取质粒备用。

表1 MMP9启动子区引物序列

1.2.2 P65过表达载体的转染

将牛乳腺上皮细胞接种至6孔板，待细胞长至70%～80%密度时进行转染。转染时分为对照组、过表达阴性对照组（转染pcDNA3.1（+）空载体）和P65过表达组（转染P65过表达载体）三组。用lipofectamineTM2000进行转染，具体操作参照说明书。转染48 h后收取样品。

1.2.3 蛋白质免疫印迹分析

转染48 h后，用RIPA裂解液收取1.2.2中各处理组的细胞总蛋白，具体操作参照说明书。按SDS-PAGE配胶试剂盒说明书配制10%的胶电泳，并用湿转法将蛋白条带转至硝酸纤维素薄膜上，时间为90 min。扫描蛋白条带，用ImageJ软件分析灰度值。

1.2.4 双荧光素酶活性检测

将Hela细胞接种至24孔板，待细胞长至90%密度时，每孔转染0.5μg空载体或P65过表达载体，与此同时分别将构建成功的4个MMP9启动子双荧光素酶报告载体质粒0.5μg或p GL3-Basic质粒和0.01μg p RL-TK质粒（用50μL Opti-MEM稀释）共转染进Hela细胞，使用2.0μL LipofectamineTM2 000试剂（用50μL Opti-MEM稀释）进行转染，24 h后测定双荧光素酶活性。NF-κB抑制实验是在0.5μg P65过表达质粒，0.5μg启动子质粒及0.01μg p RL-TK质粒共转染Hela细胞6 h后，添加NF-κB抑制剂Celastrol作为实验组，同时设置不添加抑制剂的对照组。各组均在转染24 h后收集细胞。使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光活性，通过计算其比值确定MMP9基因核心启动子片段。

1.2.5 数据分析

使用SPSS26.0和GraphPad Prism8.0对实验数据进行t-检验和方差分析并作图。数据以平均数±标准误表示，每个实验3次重复。数据标记字母相同为差异不显著，字母不同为差异显著。“*”代表P＜0.05，表示差异显著；“**”代表P＜0.01，表示差异极显著；P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与讨论

2.1 MMP9启动子双荧光素酶报告载体的构建

利用PCR技术从牛乳腺DNA中扩增获得4个不同长度的MMP9启动子片段，并连接至p GL3-Basic双荧光素报告载体中，构建4个启动子双荧光素酶报告载体，分别命名为MMP9-640、MMP9-420、MMP9-380、MMP9-80。用Kpn I和Bgl II对构建的双荧光素酶载体质粒进行双酶切鉴定，凝胶电泳预期位置出现条带，如图1所示。说明MMP9-640、MMP9-420、MMP9-380、MMP9-80双荧光素酶载体构建成功。

图1 MMP9启动子双荧光素酶报告载体双酶切结果

2.2 P65过表达对MM P9蛋白表达的影响

P65过表达载体转染牛乳腺上皮细胞48 h后，用Western blotting法检测p-P65、P65及MMP9蛋白表达。结果表明，P65过表达组的p-P65、P65、MMP9的蛋白表达量显著高于对照组和过表达阴性对照组（P＜0.05），如图2所示，说明P65过表达能促进MMP9蛋白表达。

图2 P65过表达后对牛乳腺上皮细胞p-P65、P65、MMP9表达的影响

2.3 牛MMP9启动子活性分析

在转染空载体或P65过表达载体的同时，将MMP9启动子双荧光素酶报告载体质粒或p GL3-Basic质粒和p RL-TK质粒共转染进Hela细胞，24 h后测定双荧光素酶活性。结果表明P65过表达组比过表达阴性对照组的双荧光素酶活性显著提高（P<0.05），且MMP9-640、MMP9-420和MMP9-380这3个启动子片段的活性与p GL3-Basic阴性对照组相比较均差异极显著（P<0.01），如图3所示。通过比较不同长度的启动子片段的活性值，发现MMP9-420的活性值最高，其次分别是MMP9-380和MMP9-640。且MMP9-420与MMP9-380双荧光素酶活性之间没有显著性差异（P＞0.05），说明-420～-80bp区域是转录因子NF-κB结合位点。

图3 MMP9基因启动子区不同长度片段的荧光活性

2.4 NF-κB抑制剂对MMP9转录活性的影响

在转染P65过表达载体的同时，将MMP9-420启动子双荧光素酶报告载体质粒和p RL-TK质粒共转染进Hela细胞，转染6 h后分为两组，一组添加Celastrol，另一组不添加设为对照，转染24 h后测定双荧光素酶活性。结果表明，Celastrol组双荧光素酶活性值显著低于对照组(P<0.05)，如图4所示。

图4 NF-κB抑制剂对MMP9转录活性的调节

3 结 论

NF-κB是一个转录因子家族，可与多种基因启动子区域的κB位点结合促进其转录表达[16]。黄等[19]研究发现在奶牛乳腺上皮细胞中NF-κB能促进乳合成和乳腺上皮细胞增殖。已有研究表明在人结肠癌细胞和鼠结肠癌细胞中NF-κB信号通路能正向调控MMP9表达[20-22]。但在牛乳腺上皮细胞中MMP9表达是否受NF-κB信号通路调控未见报道。本研究结果发现在牛乳腺上皮细胞中过表达NF-κB的亚基P65后，可以促进MMP9蛋白表达，表明在牛乳腺上皮细胞中MMP9的表达可受转录水平调节。MMP9是MMP家族最复杂的形式之一，可降解ECM[23]，参与乳腺重塑[24]，使乳腺发育逐步积累，提高奶牛乳产量。MMP9还可促进奶牛乳腺上皮细胞增殖[25-26]，抑制山羊乳腺上皮细胞凋亡[27]。为进一步确认转录因子NF-κB与MMP9启动子的具体结合区域，本实验构建4个不同长度的启动子双荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶实验分析各启动子片段的转录活性，得出MMP9启动子-420～-80 bp区域是转录因子NF-κB结合位点。在添加NF-κB抑制剂Celastrol后，启动子活性显著降低，进一步说明转录因子NF-κB可直接靶向奶牛MMP9基因启动子区域并促进MMP9基因表达。这一结论为我国目前奶业发展中面临的困境提供新的解决方法及思路，具有重要的生产实际意义。