长寿老人肠道乳酸菌多样性及其分离株对发酵乳品质的影响

肖石高，何梦雪，张振东，王玉荣，侯强川

（1.湖北文理学院 湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北 襄阳 441053；2.湖北澳利龙食品股份有限公司，湖北 宜昌 444199；3.宜昌市乳酸菌发酵工程技术研究中心，湖北 宜昌 444199；4.湖北文理学院乳酸菌生物技术与工程襄阳市重点实验室，湖北 襄阳 441053）

0 引 言

人类肠道中寄居着种类多样且数量庞大的微生物，它们影响着人体对营养物质的吸收和代谢，并与人体健康密切相关[1]。研究发现，肠道菌群与糖尿病[2-3]、脂肪肝[4]、心血管疾病[5]和自闭症[6-7]等多种疾病密切相关。同时，不同年龄的人群肠道菌群亦存在较大差异，这可能与衰老导致的人体身体素质和消化机能下降、代谢减慢等一系列变化有关[8]。此外，平均寿命不同的地区，老年人肠道菌群组成展现出明显差异，例如Park等人的研究报告显示韩国长寿村40岁以上人群肠道中的乳酸菌如乳酸杆菌属和乳球菌属的相对含量远高于城市居民[9]。这些研究一方面表明乳酸菌与长寿之间存在密切关系，另一方面，长寿老人肠道菌群可以作为益生乳酸菌的重要来源之一。但截止目前，关于中国长寿老人肠道乳酸菌多样性的研究尚少，使得后续对基于长寿老人肠道菌群的益生乳酸菌分离和筛选缺少方向。

之前的研究已经发现乳酸菌的持续摄入对包括老年人在内的各年龄段人群健康起着重要的调节作用[10]。随着人们对营养和保健的追求，作为益生乳酸菌重要载体的酸奶受到越来越多消费者的亲睐。酸奶是由原料乳经乳酸菌发酵制作而成，在发酵的过程中乳糖、蛋白质、脂肪等大分子会部分分解为小分子的乳酸、肽、氨基酸、脂肪酸等[11]，这一方面提高了牛奶的风味，另一方面也更容易被人体消化吸收，降低了乳糖不耐症等情况的发生。除此之外，酸奶还具有平衡人体肠道菌群、降低胆固醇、调节免疫能力和抗氧化等作用[12-14]。在酸奶制作的过程中，影响其品质的一个重要因素是发酵剂的发酵特性，所以制作高品质酸奶的前提是筛选具有优良发酵特性和益生特性的乳酸菌菌株[15-16]。因此，通过对长寿老人肠道乳酸菌多样性进行研究，在此基础上评价和筛选性状优良的乳酸菌具有重要的现实意义。

本研究首先对采集自恩施地区长寿老人的粪便样品通过纯培养方法对样品中的乳酸菌进行分离与鉴定，确定了长寿老人肠道中的优势乳酸菌。在此基础之上，对其优势乳酸菌菌株发酵制作的发酵乳使用电子鼻、电子舌和高效液相色谱等检测手段进行了评价与分析，为后续具有优良益生特性菌株的筛选开发奠定了一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MRS培养基，青岛海博生物技术有限公司；十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、乙酸钠、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、乙醇、偏重亚硫酸钾、碳酸钠和碳酸钙（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司；细菌16S：rRNA通用引物27F/1495R，武汉天一辉远生物科技有限公司合成；溶菌酶、蛋白酶K、2×PCR：mix和p MD19-T载体，宝生物工程（大连）有限公司；PCR产物清洁试剂盒，爱思进生物技术（杭州）有限公司；阴离子溶液、阳离子溶液、内部溶液和参比溶液，日本Insent公司；盐酸、硼酸、硫酸、氢氧化钠、氯化钠、硫酸铜、酚酞、硝酸银、邻苯二甲酸氢钾、磷酸二氢钾、铬酸钾和硫酸钾（均为分析纯），成都市科龙化工试剂厂；酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸（优级纯），西陇科学股份有限公司；乙腈和异丙醇（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FluorChem：FC3化学发光凝胶成像系统，美国FluorChem公司；DG250厌氧工作站，英国DWS公司；DYY-12电泳仪，北京六一仪器厂；vetiri梯度基因扩增仪，美国AB公司；ECLIPSE：Ci生物显微镜，日本Nikon公司；LC-20ADXR高效液相色谱仪，日本岛津公司；Inertsil：ODS-SP：C18色谱柱（150×4.6mm，5μm），日本岛津公司；V-1800型可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；SA-402B电子舌，日本Insent公司；CYB40-10S高压均质机，上海东华高压均质机厂。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集

粪便样品收集自恩施市花果山社会福利院和六角亭老街街坊敬老院；老人年龄为90～95岁（7女2男），且近3个月未服用益生菌或抗生素药物，无感冒，肠炎等病症。粪便样品采集时间为早上6：00～9：00。样品采集后，装入厌氧袋置于低温采样箱中，迅速带回实验室进行后续实验。

1.3.2 乳酸菌的分离与鉴定

先将粪便样品进行梯度稀释：称取10 g粪便到含有90 mL无菌生理盐水（0.85%的氯化钠溶液）的三角瓶中并混匀（10-1稀释液），取混匀的稀释液0.5 mL移入于另一个含4.5 mL生理盐水的试管中混匀（为10-2稀释液），接着取0.5 mL的稀释液重复上述步骤，分别得到10-1到10-7梯度的稀释样品，取其中的10-4、10-5、10-6梯度的稀释液各100 mL涂布于含1.0%碳酸钙的MRS固体培养基平板。将平板放入温度为37℃的厌氧工作站培养48 h左右。随后挑取平板中有钙溶圈的单菌落，使用MRS固体培养基划线纯化，通过革兰氏染色检验菌种形态与纯度后，将菌株保存在含20%甘油的MRS培养基，在-80℃保存备用。

通过CTAB法提取上述纯化过的菌株DNA，并以之为模板，使用细菌16SrRNA通用引物27f（5’–AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和1495r（5’–CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’）进行PCR扩增。扩增体系为25μL的2×PCR mix（含Mg2+，dNTP和rTaq），1μL 27f（10 mmol/L），1μL 1495r（10 mmol/L），10～50 ng DNA模板，加无菌dd H2O至50μL。反应条件：94℃4 min预变性；94℃60 s变性，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，循环30次；72℃延伸l0 min。将PCR产物纯化后，连接到T-载体并转化E.coli top10大肠杆菌细胞，在含有氨苄青霉素钠的平板上过夜培养后，挑取阳性克隆子，送到武汉天一辉远生物科技有限公司测序。

将测序得到的序列拼接与去引物后，提交到NCBI数据库中进行Blastn比对，下载相似度较高的模式菌序列与本研究的菌株序列一起使用MEGA X软件基于邻接法（Neighbor-joining）构建系统进化树（设置Bootstrap为1 000次），以确定菌株的系统分类地位。

1.3.3 发酵乳的制作工艺流程

发酵乳的制作参照杨发容等[17]的方法进行。发酵乳的总体工艺流程为：奶粉→制备复原乳→水合→均质→杀菌→降温→接种乳酸菌→发酵→冷却后熟→成品（4℃下保藏）。具体流程为，首先制备复原乳，使用的奶粉、蔗糖和水按照11.5∶6.5∶82的质量比混合均匀；水合：将复原乳于65℃保温30 min；均质：将灌装好的奶液进行两段均质，一段20 MPa，第二段4 MPa；杀菌：将均质好的奶液加热至95℃左右，保温5 min；接种乳酸菌：提前活化菌体，按照5×106CFU/mL复原乳的比例接入提前制备好的乳酸菌悬液；发酵：将加完菌液的复原乳置于42℃的恒温箱中发酵24 h；后熟：将发酵凝乳好的乳制品置于4℃的冷藏柜中冷藏24 h，完成后熟。

1.3.4 发酵乳气味的测定

称取10 g发酵乳样品于25 mL样品瓶中，放置至室温，然后参照朱丹实等[18]的方法对发酵乳样品的挥发性风味物质进行检测。具体参数设置为：传感器清洁时间为90 s，调零时间为5 s，进样吸气流量为200 mL/min，测定时间为60 s，样品间间隔90 s，最终选取各样品在49 s、50 s和51 s时的响应值进行分析。

1.3.5 发酵乳的滋味的测定

称取50 g发酵乳样品，加入150 mL去离子水稀释，设置转速12 000 r/min离心10 min；收集上清液，弃沉淀，然后参照郭壮等[19]的方法对其酸味、苦味、涩味、咸味、鲜味、后味A（涩的回味）、后味B（苦的回味）和丰度（鲜的回味）相对强度进行检测。

1.3.6 发酵乳的有机酸含量测定

称取2.0 g发酵乳样品至10 mL的容量瓶中，使用流动相（0.01 mol/L的K2HPO4）定容至10 mL，以12 000 r/min的转速离心10 min。取上清液，121℃高压处理15 min后，再次12 000 r/min离心10 min，然后取上清液过0.22μm微孔纤维素滤膜，滤液备用。参照杨成聪等[20]的方法对发酵乳中有机酸的含量进行检测：检测器使用紫外-可见光检测器，检测波长为215 nm，流动相为0.01 mol/L的K2HPO4（p H值为2.30），进样量20μL，流速为1.0 mL/min，柱温为25℃。

1.3.7 统计分析

使用Mann-Whiney检验对发酵乳的组间差异进行分析，使用vegan包进行主成分分析法（principal component analysis，PCA）以对分析发酵乳的品质指标进行排序分析；并使用Origin 2017软件绘制箱形图和散点图。

2 结果与讨论

2.1 长寿老人肠道乳酸菌分离与分子鉴定

本研究通过传统纯培养方法，在厌氧条件下，从恩施长寿老人的粪便样品中分离和纯化得到28株菌株，并基于细菌16SrRNA进行了鉴定。

基于分离菌株16SrRNA基因构建的系统发育树见图1。由图1可知，所得到的28株乳酸菌被鉴定为2个属分别为乳杆菌属（Lactobacillus）和肠球菌属（Enterococcus），进一步归为6个种。分离到的28株菌中的HBUAS54003等12株菌被鉴定为唾液乳杆菌（L.salivarius）；HBUAS54006等9株菌被鉴定为发酵乳杆菌（L.fermentum）；菌株HBUAS54038被鉴定为泰国肠球菌（Enterococcus thailandicu）；菌 株 HBUAS54037、HBUAS54019和HBUAS54036与Enterococcus faeciumLMG11423T的进化关系较近，被鉴定为Enterococcus faecium；菌株HBUAS54027被鉴定为植物乳杆菌（L.plantarum）；菌株HBUAS54005和HBUAS54022被鉴定为粘膜乳杆菌（L.mucosae）。总而言之，从恩施地区长寿老人肠道分离到的乳酸菌以唾液乳杆菌和发酵乳杆菌为主。

图1 恩施地区长寿老人肠道中乳酸菌分离株系统发育树

2.2 发酵乳气味品质评价分析

来源于人体肠道的乳酸菌一般具有较好的胃酸、胆盐和消化液的耐受能力，发挥益生功效的潜力往往也较强[21]。根据卫生部印发的《可用于食品的菌种名单》（2016版），唾液乳杆菌和发酵乳杆菌均可在食品工业中使用，因此，本研究将在恩施长寿老人肠道中分离株最多的唾液乳杆菌（共12株）和发酵乳杆菌（共9株）分别用于发酵乳的制备，并对发酵乳的气味和滋味品质进行评价，以初步筛选适用于发酵乳制作的菌种。首先，使用电子鼻技术对各发酵乳样品中挥发性物质进行了测定，其结果如表1所示。

由表1可知，以恩施长寿老人粪便样品中分离出的唾液乳杆菌和发酵乳杆菌制备的发酵乳在多个传感器指标上存在显著差异，其中W 1C、W 3C和W 5C在唾液乳杆菌组含量显著较高（P<0.05），而W1S、W 2S和W 3S在发酵乳杆菌组显著较高（P<0.05）。该结果表明，唾液乳杆菌制作的酸奶芳香型风味物质含量更高，而发酵乳杆菌制作的酸奶烷烃类和乙醇的含量更高。从发酵乳香气的角度考虑，唾液乳杆菌更适合用作发酵乳生产。

表1 电子鼻各传感器对发酵乳响应值的差异性分析

2.3 发酵乳滋味品质分析

滋味是发酵乳的另一个重要品质，是人们对食品中味感物质的总体感觉。因此，本研究同时使用电子舌技术对发酵乳样品的滋味进行了评价，并比较了唾液乳杆菌和发酵发酵乳杆菌制备的发酵乳之间各滋味品质的差异，其结果见图2。

图2 发酵乳滋味品质评价箱型图

由图2可知，两组发酵乳样品在苦味、酸味、涩味、咸味、鲜味、后味-A（涩味的回味）和丰度（鲜味的回味）上均表现出极显著的差异（P<0.05），而在后味-B（苦味的回味）方面无显著差异（P>0.05）。电子舌的检测结果显示使用唾液乳杆菌制备的发酵乳在酸味、涩味及后味-A（涩味的回味）显著强于发酵乳杆菌组，而苦味、鲜味和咸味上的强度显著弱于发酵乳杆菌发酵组。酸味作为发酵乳制品的特征滋味，因此唾液乳杆菌发酵的发酵乳在滋味品质上具有一定优势。

2.4 发酵乳气味和滋味的综合评价分析

为进一步综合评价唾液乳杆菌和发酵乳杆菌制备的发酵乳的品质，我们以电子鼻和电子舌的检测数据基于多元统计进行综合排序分析，得到主成分因子载荷图（图3a）和因子得分图（图3b）。分析可知，PC1主要由酸味、鲜味、W 1C、W 3C、W 5C、W 1S和W 2S等7个指标构成，PC2主要由后味A（涩的回味）、苦味、咸味和W 2W等4个指标构成。PC1中的正相关指标主要是鲜味、W 1S和W 2S等，PC2中的正相关指标主要是苦味和咸味等。基于PCA的因子得分图可知，两组发酵乳样品在因子得分图中的空间分布呈现明显的分离趋势，可见不同种乳酸菌菌株制备的发酵乳在滋味和气味指标方面存在明显的差异。

图3 基于PCA的因子载荷图（a）和因子得分图（b）

2.5 发酵乳中有机酸含量的分析

为进一步明确唾液乳杆菌和发酵乳杆菌发酵乳制备时产生的有机酸种类和含量，本研究采用高效液相色谱法检测了2组发酵乳样品中的有机酸，见表2。

表2 发酵乳有机酸含量

由表2可知，两组发酵乳样品中乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的含量存在显著差异（P<0.05）。其中，唾液乳杆菌组发酵乳中乳酸和柠檬酸的含量显著较高，而乙酸和琥珀酸的含量显著较低。有机酸是水果和蔬菜中的天然呈味剂，被广泛的应用到现代食品工业中。乳酸是发酵乳中特征有机酸类型，乳酸的口感较柔和，且不掩盖发酵乳本身的芳香[22]。本研究中，唾液乳杆菌发酵乳的乳酸平均含量是发酵乳杆菌组的3倍多，因此前者用来发酵酸乳会凝乳更快，发酵效率更高，口感更好，用来发酵酸乳会更有优势，如果与其他产香乳酸菌复配，则更有利于生产出品质优良的酸乳。

3 结 论

从恩施地区的9份长寿老人粪便样品分离到了28株乳酸菌，鉴定为2个属的6个种，其中唾液乳杆菌和发酵乳杆菌在分离株中所占的比例最高。以唾液乳杆菌和发酵乳杆菌为发酵剂制备发酵乳，并进行品质评价，发现以唾液乳杆菌制备的发酵乳芳香型物质、乳酸产量等指标均优于发酵乳杆菌，提示唾液乳杆菌在酸奶生产中可能具有更大的潜力。本研究揭示老年人肠道乳酸菌的主要组成类群，并为后续具有益生功效发酵乳的制备提供了乳酸菌菌种资源。