复合益生菌酸马奶的研制及其对肠道菌群的影响

伊再提古丽·外力，阿力米江·奥布力塔力甫，马建宝，卡丽比奴尔·艾尔肯，古丽巴哈尔·卡吾力

（新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011）

0 引 言

随着人们生活条件的不断提升，对食品的要求也越来越高。其中，乳制品在人们日常食物中占据重要地位。嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌等是益生菌中常见的菌种，以酸奶为首的乳制品是益生菌最主要的载体[1]。单菌的发酵过程及产品安全性可控，是近代微生物学的巨大进步，然而单菌株的功能特性，因菌株代谢产物不同而造成明显差异，具体应用受到限制。近年来，随着基因组学、代谢组学及肠道微生物理论的发展，筛选具有特定功能特性的益生菌，将其复配用于功能食品的开发具有重要的意义。

肠道内寄居着大量微生物，包括细菌、真菌及病毒等，其中主要以细菌为主，其数量可达1015个[2-3]。近年来的研究表明，肠道菌群在人类的多种疾病发生发展中扮演了十分重要的角色[4]。肠道菌群作为肠道内的正常微生物群，不仅对肠道的生理功能起重要作用，而且对宿主的生理、代谢、免疫、消化和营养的摄取功能也至关重要[5]。肠道菌群的紊乱不仅与溃疡性结肠炎、便秘、腹泻及大肠癌等肠道消化系统的疾病有关，同时与代谢性疾病、心脑血管及免疫疾病相关[6-9]。益生菌对各类消化道等疾病具有一定的治疗及预防作用，在改善肠道菌群数量及菌种组成等方面发挥着重要的角色。益生菌对人体的作用包括：提高免疫力，促进肠道菌群正常化，维持正常的肠道功能，促进营养物质的吸收，降低胆固醇水平，延缓机体衰老，改善血脂代谢等[10]。研究表明，益生菌进入人体肠道后，能代谢并产生有机酸，抑制某些有害细菌的生长，从而调节肠道菌群结构[11]。

马奶就营养学角度讲，属于完全蛋白质，富含人体所必需的氨基酸(EAA,Essential Amino Acid)9种，与人乳十分相近[12]。由于马奶具有高乳糖的特点，最适宜生产发酵乳制品，如酸马奶[13]。医疗实践证明，酸马奶可增强机体免疫功能，对心血管疾病、消化系统疾病、呼吸系统疾病、糖尿病以及某些癌症等具有一定的防治作用或辅助疗效[14-15]。本研究团队在前期工作中对鲜马奶免疫调节、抗疲劳和抗氧化等保健功能进行了系统的研究，并从乳清分离纯化具有抗肺癌功能的活性肽，说明了鲜马奶医疗价值。为了进一步研究鲜马奶医疗价值，丰富市场乳酸菌产品的种类以更加满足需求，本研究通过单因素和正交实验设计筛选复合益生菌酸马奶发酵条件、考察其初步稳定性，并研究对SD大鼠肠道菌群的影响，为其后期保健功能研究提供了数据基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

马奶粉，新疆特丰药业股份有限公司；保加利亚乳酸菌、嗜热链球菌，保加利亚拉科迪纳有限公司；5（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌）、7（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌BB-12、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌）、10（保加利亚乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种、鼠李糖乳杆菌）、16种菌粉（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧菌、鼠李糖乳杆菌、格氏乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种），北京川秀科技有限公司；酸马奶，新疆乌鲁木齐南山牧场；MC培养基，北京索莱宝科技有限公司（LA5600）；MRS培养基，北京索莱宝科技有限公司（M 8330）；硫酸钴，天津市大茂化学试剂厂（10124-43-3）；邻苯二甲酸氢钾，天津市大茂化学试剂厂（877-24-7）；厌氧产气袋，日本三菱化学公司（0170ZJ-3）；指示剂，日本三菱化学公司（9212AD）。

PB-10酸度计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；AB135-S电子分析天平，梅特勒METTLER TOLEDO；311恒 温 培 养，Thermo Fisher Scientific；BCD-239SK DE冰箱，青岛海尔股份有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司；DL-1电子万用炉，北京市永光明医疗仪器有限公司；sw-cj-2fd超净台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

选3月龄健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠40只，体质量250～350 g左右，由新疆医科大学动物中心提供，质量许可证号：SCXK(新)2018-0002。所有动物饲养在室温22～25℃、湿度40%～60%，自然昼夜节律光照条件下，以普通饲料喂养，自由进食饮水。

1.2 方法

1.2.1 指标测定

1.2.1.1 工艺流程

酸奶瓶灭菌→奶粉复原→杀菌→冷却→加入菌粉→发酵→冷却→冷藏

1.2.1.2 酸度的测定

酸度测定按照中华人民共和国国家标准《GB5009.239—2016食品安全国家标准食品酸度的测定》进行。

1.2.1.3 乳酸菌数测定

乳酸菌的测定按照中华人民共和国国家标准《GB 4789.35—2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》进行。

1.2.1.4 复合益生菌酸马奶的评价标准

选择10名品评人员，取适量试样置于杯子中，用温开水漱口，按照表1对复合益生菌酸马奶品质进行打分并通过对复合益生菌酸马奶的色泽、香味、滋味、组织状态4个状态进行感官评定，分数越高说明复合益生菌酸马奶品质越好。

表1 复合益生菌酸马奶的评价标准

1.2.2 单因素试验

根据查阅文献和预实验[16-18]，分别以菌种、菌粉添加量、发酵时间、以及发酵温度为考察因素，以复合益生菌酸马奶的酸度和感官评价为考察指标，每个样品平行测3组，筛选复合益生菌酸马奶发酵条件为进一步进行正交实验提供数据支持。

1.2.2.1 菌种的筛选

将喷干马奶粉配成10%复原乳，按照2%的菌粉量，在40℃条件下，分别加入2、5、7、10、16种菌粉，发酵16 h，测定其酸度，以感官评价为考察指标确定菌种。

1.2.2.2 菌粉添加量

将喷干马奶粉配成10%复原乳，在40℃条件下，加入5种菌，菌添加量分别为1%、1.5%、2%、2.5%、3%，发酵16 h，测定其酸度，以感官评价为考察指标确定菌粉添量。

1.2.2.3 发酵温度的筛选

将喷干马奶粉配成10%复原乳，按照2%的量，加入5种菌粉，分别在36、38、40、42、44℃时发酵16 h，测定其酸度，以感官评价为考察指标确定温度。

1.2.2.4 发酵时间的筛选

将喷干马奶粉配成10%复原乳，按照2%的量，加入5种菌粉，在40℃条件下，分别发酵8、12、16、20、24 h，以感官评价为考察指标确定发酵时间。

1.2.3 正交实验设计

以乳酸菌菌种数（2、5、10种菌）、菌粉添加量（1%、2%、3%）、发酵温度（40、42、44℃）、发酵时间（12、16、20 h）为考察因素，通过L9（34）正交试验设计，每个样品平行测3组，通过酸度和感官评定筛选出最优发酵条件。

1.2.4 验证实验

根据正交实验设计结果进行3次重复性试验，进一步确定复合益生菌酸马奶发酵条件。

1.2.5 复合益生菌酸马奶初步稳定性研究

按以上最优方法制备复合益生菌酸马奶，放置在4℃冰箱，每天记录酸度变化，每隔2 d检测样品乳酸菌活菌数。

1.2.5 复合益生菌酸马奶对肠道菌群的影响

1.2.5.1 动物分组及干预

将40只SD大鼠按随机原则分为正常对照组、传统酸马奶组（2 mL/100 g）、复合益生菌酸马奶高、中、低剂量组（3、2、1 mL/100 g），每组8只。各组大鼠连续灌胃60 d；

1.2.5.2 大鼠粪便的收集

分别于实验灌胃结束后，每组选取6只，在无菌条件下同一时间段按摩大鼠腹部使其在规定时间内排便，排粪便一到两颗粒时收集于无菌EP管中，-80℃冻存。各组大鼠粪便样本送至上海美吉生物医药科技有限公司进行16 s区域扩增子高通量测序分析。

1.2.6 统计分析

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 菌种的筛选

由图1可知，当其他因素相同，菌种数量分别为2、5、7、10、16种时，感官评分分别为81.4、84.5、81.1、81.9、81.2分。5种菌感官评分最高，其酸奶颜色呈乳白色，乳体均匀一致，无沉淀物，马乳香清雅，纯正，酸味儿适口，无异味。其次是10种菌种制备的益生菌酸马奶和2种菌种制备的益生菌酸马奶。

图1 菌种对益生菌酸马奶品质的影响

2.1.2 菌粉添加量

由图2可知，当其他因素相同，菌粉添加量分别为1%、1.5%、2%、2.5%、3%时，酸度随菌粉添加量呈增长趋势。感官评分分别为84.1、83.5、86.4、83.7、84.7分。由发酵后产品的评分可以看出，当菌粉添加量为2%时，产品的感官评分最高。当菌量为2%时，益生菌酸马奶味道纯正，其次是3%和1%。

图2 菌量对益生菌酸马奶品质的影响

2.1.3 发酵温度的筛选

由图3可知，当其他因素相同，发酵温度分别为36、38、40、42、44℃时，酸度随发酵温度呈增长趋势。感官评分分别为82.8、83.2、84.7、84、84.2分。由发酵后产品的评分可以看出，当发酵温度为40℃时，产品的感官评分最高，其次是42℃和44℃。

图3 发酵温度对益生菌酸马奶品质的影响

2.1.4 发酵时间的筛选

由图4可知，当其他因素相同，发酵时间分别为8、12、16、20、24 h时，酸度随发酵时间的增大而增大。感官评分分别为82.7、84.1、85.5、84.3、82.1分。由发酵后产品的评分可以看出，当发酵时间为16 h时，产品的感官评分最高，其次是12 h和20 h。

图4 发酵时间对益生菌酸马奶品质的影响

通过表3和表4可知，以酸度为评价指标得出的结果无显著性差异，故无统计学意义。以感官评分为评价指标时，通过正交试验正交表中极差R值和方差分析表中的方差分析，4种因素中对益生菌酸马奶质量影响大小的顺序A＞B＞C＞D，各因素对复合益生菌酸马奶的影响以菌种最大，其次为菌添加量、发酵温度及发酵时间。其中菌种对本实验有显著性影响。故确定益生菌酸马奶研制的最佳工艺为A2B2C2D3，即5种菌种，菌粉添加量为2%，发酵温度为42℃，发酵时间为20 h。在此条件下制备的复合益生菌酸马奶，颜色呈乳白色，乳体均匀一致，无沉淀物，马乳香清雅，纯正，酸味儿适口，口感风味较佳。

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验结果

（续表3）

表4 方差分析结果

2.2 验证实验

发酵条件为5种菌种（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌），菌粉添加量为2%，发酵温度为42℃，发酵时间为20 h，进行3次平行实验，酸度为55.4°T，感官评分为89.6，因此确定A2B2C2D3为最佳条件。

2.3 储藏期稳定性研究

2.3.1 储藏期酸度变化

由图5可知，益生菌酸马奶制备好第一天酸度是最高的，味道最纯正，颜色呈乳白色，乳体均匀一致，酸味儿适口，无异味。第13天开始酸度基本保持不变，15 d以内酸度符合标准（DBS 65/**-2019），说明本研究优化所得的益生菌酸马奶在货架期内口感和风味比较稳定，满足市场销售需要。

图5 冷藏过程中酸度的变化

2.3.2 储藏期乳酸菌数的变化

早期研究发现酸奶等发酵乳制品具有改善胃肠炎的功效，甚至具有延年益寿的作用。随后研究发现这些发酵乳制品的潜在作用和机制与乳酸菌等细菌的存在密切相关，其发酵产物可以抑制肠道病原体产生的毒素，促进宿主细胞的健康[19]。由图6可以看出本研究制备的益生菌酸马奶乳酸菌在整个储藏期是比较稳定的，乳酸菌数均达到1×108CFU/g以上。

图6 冷藏过程中乳酸菌数变化

2.3.3 复合益生菌酸马奶对肠道菌群的影响

2.3.3.1 Alpha多样性分析

由图7稀释曲线可以看出随着测序量的增加，物种的丰富度增加呈平缓趋势提示本次测序深度充分已覆盖样本中的所有物种。

图7 各组样本的稀释曲线

由图8可以看出，与正常对照组相比，传统酸马奶组与复合益生菌酸马奶高、中剂量组的Simpson指数无显著性差异，而低剂量的酸马奶显著高于正常对照组（P<0.05）。说明低剂量的酸马奶可提高肠道菌群的多样性。正常对照组与传统酸马奶组以及复合益生菌酸马奶高、中、低剂量组相比Shannon指数均无显著性差异，但低剂量组与传统酸马奶组、复合益生菌酸马奶高和中剂量组相比，Shannon指数显著降低（P<0.05）；正常对照组和传统酸马奶组、复合益生菌酸马奶中、低剂量组均无显著性变化，高剂量组高于其他组但无显著性差异（P>0.05）。

图8 各组大鼠肠道菌群的Simpson、Shannon、Chao1多样性指数展示

2.3.3.2 Beta多样性分析

当前所展示的平面坐标系，可解释所有样品间总差异的19.6%，各组间存在显著差异(P<0.01)，如图9～10所示。从图中可以看出，传统酸马奶组、复合益生菌酸马奶高、中剂量组的聚在一起，低剂量组与正常对照组距离较远。说明高、中剂量的复合益生菌酸马奶和传统酸马奶对肠道菌群的多样性影响比较接近。

图9 各组大鼠肠道菌群的PCoA展示

图10 各组大鼠肠道菌群的CCoA展示

2.3.3.3 肠道菌群结构分析

在门水平，选取丰度前4的细菌进行展示，厚壁菌门在正常对照组、传统酸马奶组、复合益生菌酸马奶高、中、低剂量组中的相对丰度分别为81.21%、73.74%、69.62%、67.68%、84.32%，拟杆菌门在正常对照组、传统酸马奶组、复合益生菌酸马奶高、中、低剂量组中的相对丰度分别为14.29%、22.78%、26.92%、29.78%、12.72%，如图11所示；在属水平丰度排名前10的细菌分别是Ligilactobacillus、Duncaniella、Lactobacillus、Bacteroides、Ruminococcus、Romboutsia、Desulfovibrio、Muribaculum、Limosilactobacillus，如图12所示。

图11 各组大鼠肠道菌群在门水平下的组成

图12 各组大鼠肠道菌群在属水平下的组成

2.3.3.4 肠道菌群的差异性分析

正常对照组与传统酸马奶组相比，在门水平下无显著性差异；在属水平下，传统酸马奶组升高了Roseburia、Bacteroides的丰度，显著降低了Turicibacter、Romboutsia的丰度，如图13所示。复合益生菌酸马奶高剂量组跟正常对照组相比，在门水平下，显著升高了厚壁菌门（Bacteroidetes）的丰度；在属水平，显著升高了Duncaniella、Oscillibacter的丰度，显著降低了Clostridium_sensu_stricto、Turicibacter、Romboutsia的丰度，如图14所示。复合益生菌酸马奶中剂量组与正常对照相比，在门水平下，显著升高了拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度；在属水平下，显著升高了Acetivibrio、Duncaniella的丰度，显著降低了Turicibacter，如图15所示。低剂量组与正常对照相比，在门水平下，无显著差异；在属水平下，显著降低了Clostridium_sensu_stricto、Turicibacter、Romboutsia的丰度如图16所示。

图13 正常对照组与传统酸马奶组LEfSe结果

图14 正常对照组与高剂量组LEfSe结果

图15 正常对照组与复合益生菌酸马奶中剂量组LEfSe结果

图16 正常对照组与复合益生菌酸马奶低剂量组LEfSe结果

3 结 论

人们生活水平的提高对食品的保健功能提出了更高要求，复合益生菌酸奶逐渐被人们所重视。优化复合益生菌酸奶的发酵条件成为目前人们研究的重点。酸马奶是一种以马奶为基料发酵的低酒精含量的发酵乳制品，一般通过乳酸菌和酵母菌混合酵制而成[20]。传统酸马奶是通过木材器具、动物皮或瓷器中自然发酵制成的[21]。本研究以感官评分为指标，在单因素试验基础上进行正交试验确定了复合益生菌酸马奶配方和工艺，复合益生菌酸马奶研制的最佳工艺为添加5种菌种，菌粉添加量为2%，发酵温度为42℃，发酵时间为20 h，制备方法简单，口感清爽。在15 d之内酸度和乳酸菌数量均符合标准（DBS 65/**-2019），初步稳定性良好，乳酸菌数均达1×108CFU/g以上，说明复合益生菌酸马奶所选发酵条件符合要求，结果稳定可靠。

寄生在肠道内的细菌是一类具有非常重要功能的细菌，对人类生活方式有较大的影响。肠道菌群不仅可以分解食物和存储脂肪，还能促进免疫系统发育、血管合成以及对神经系统进行调控。拟杆菌是广泛分布在哺乳动物体内的细菌，属于人类肠道中主要细菌，在糖尿病、肥胖[22-23]等疾病中发挥有益作用。本次研究采用不同剂量的复合益生菌酸马奶及传统酸马奶对正常大鼠进行灌胃，探究其对肠道菌群的影响并发现复合益生菌酸马奶高、中剂量组在门水平上，显著升高了拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度，在属水平上显著升高了Duncaniella丰度。低剂量组在属水平上，显著升高乳酸杆菌（Lactobacillus），增加Ligilactobacillus、Limosilactobacillus等有益菌丰度。近期研究发现Ligilactobacillus、Limosilactobacillus被分列为乳酸杆菌里的新菌属，推测可能对机体产生益生作用[24]。本研究采用Chao1、Simpson、Shannon多样性指数来反映肠道菌群的丰富度和多样性，复合益生菌酸马奶对正常大鼠肠道的影响研究中发现传统酸马奶组、复合益生菌酸马奶高、中剂量组对肠道菌群的α多样性没有显著性影响，提示这些酸奶对正常大鼠肠道菌群的整体性结构影响不大；低剂量复合益生菌酸马奶可以显著升高Simpson指数，说明低剂量的复合益生菌酸马奶影响肠道菌群的多样性。β多样性分析显示，高、中剂量的复合益生菌酸马奶和传统酸马奶肠道菌群的多样性影响比较接近。绿脓杆菌（Turicibacter）是厚壁菌门中的一个属，多项研究显示该菌属于促炎菌[25-27]。余莉[28]团队研究显示，与青年健康组相比，老年人肠道中的Turicibacter显著升高。在抑郁症和肥胖症的小鼠模型中，Turicibacter丰度显著升高[29]。David Ma[30]研究发现生酮饮食降低阿尔兹海默症的风险与肠道中Turicibacter的相对丰度降低有关。本研究中复合益生菌酸马奶高、中、低剂量组在属水平上显著降低了Turicibacter，进一步说明了酸马奶对健康的好处。综上所述，复合益生菌酸马奶在一定程度上可通过调节肠道菌群多样性和结构，进而影响机体健康。

随着酸马奶的商业化，其相关产品已被广大消费者所认知与接受，且其销售地区范围也在不断扩大。酸马奶对人体健康的有益功能已被证明。然而，对酸马奶的功能研究不应忽视。肠道中数以万亿计的微生物，对人类健康也有重大影响。酸马奶中的功能性成分可能会与这些肠道微生物群相互作用，对人类健康发挥积极作用。本研究旨在探讨酸马奶对肠道微生物区系组成的影响，为进一步研究酸马奶的功能提供依据。