自动QuEChERS前处理方法结合HPLC-MS/MS测定生牛乳中112种农药残留

王帅，赵海涛，闫艳华，刘会会，王雅静，张亮，王磊

(1.唐山市食品药品综合检验检测中心，河北 唐山063000；2.河北省农产品质量安全检测技术创新中心，河北唐山063000；3.唐山市功能性农产品产业技术研究院，河北唐山063000）

0 引 言

随着全球范围内乳及乳制品的需求量增大，世界各国对生牛乳中农药残留检测越来越重视[1-4]。生牛乳中的农药残留主要来源喂食奶牛的饲料，其所含农药种类范围较广，残留量相对较高，但现有的方法难以同时分析生牛乳基质中不同类型的农药残留[5-10]。

目前，按照GB/T 5009.162—2008《动物性食品中有机氯农药和拟除虫菊酯农药多组分残留量的测定》的规定对生牛乳进行检测[11]。通过实践发现，国标方法操作繁琐、有机试剂耗费量净化不充分，导致检测结果的不确定性增加。田宏哲等[12]采用乙腈、Oasis HLB提取净化后，利用HPLC-MS/MS测定牛奶中6种氨基甲酸脂类农药；陈美瑜等[13]利用GC-MS/MS结合基质固相分散前处理对牛奶中32种农药进行检测；刘毅等[14]建立了牛奶中20种有机氯农药残留的GC-MS/MS检测方法；可以看出，国内的研究主要还停留在对单一类农药的检测[15-16]。因此，建立一种净化效果好、准确度高，可满足同时测定生牛乳中多类农药残留的快速检测方法，具有重要意义。

本研究采用自动QuEChERS-液相色谱串联质谱技术，建立生牛乳中112种农药残留的高通量检测方法，涉及农药种类全，涵盖了杀虫剂类、杀菌剂类、除草剂类等农药。前处理方法有效的减少试剂用量，解放劳动力，缩短前处理时间，可满足国内外对生牛乳中农药残留的测定需求。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

LCMS-8040液相色谱质谱联用仪，配有电喷雾离子源（ESI），日本岛津公司；SiO-6512全自动前处理设备，本立科技公司；SZ 13022-NY0.2μm有机滤膜，天津市领航实验设备股份有限公司；T-200电子天平，常熟双杰仪器制造厂。

1.1.2 试剂与材料

标准品氧乐果、二甲戊灵、氟虫腈等112种均购于农业部环境保护科研监测所；提取剂内含5.5 g无水硫酸镁、1.5 g氯化钠、0.5 g柠檬酸氢二钠及1 g柠檬酸钠，净化剂内含4 mm氧化锆珠5粒、100 mgN-丙基乙二胺（PSA）、600 mg无水硫酸镁及100 mgC18，氧化锆珠（R 104）和双层提取净化管（V50），均购于本立科技公司；乙腈为色谱纯；0.05%甲酸溶液；5 mmol/L甲酸铵溶液；实验用水为蒸馏水（屈臣氏）；生牛乳样品，购买于唐山市市场。

1.2 实验方法

1.2.1 混合标准储备溶液的配制

混合标准储备溶液：分别吸取浓度为1 000μg/m L的单个农药标准物质100μL，用乙腈定容至10 mL，得到浓度为10μg/mL的混合标准溶液，于4℃冰箱内保存。

1.2.2 基质混合标准工作液的配制

农药基质混合标准工作液：取样品空白溶液分别配制0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.2μg/mL的基质混合标准工作液，现用现配。

1.2.3 精密度测定方法

取空白生牛乳样品，添加农药混合标准溶液，添加浓度0.02、0.12、0.2 mg/kg，每个浓度做3个平行，根据精密度公式可计算样品精密度。

式中：RSD为相对标准偏差；s为标准偏差；x为算数平均值；xi为样品测定值；n为样品重复测定次数。

1.2.4 回收率测定方法

式中：C0为回收浓度；C1为样品添加浓度。

1.2.5 样品前处理

称取5.0 g生牛乳样品于离心管外管中，加入混合标准溶液（外标法），静置30 min，加入10 mL乙腈及10 mL水，加入萃取盐包（内含5.5 g无水硫酸镁，1.5 g氯化钠，0.5 g柠檬酸氢二钠，1.0 g柠檬酸钠）及10颗锆珠，拧紧内管（内含4 mm氧化锆珠5粒，100 mg PSA，600 mg无水硫酸镁，100 mg C18）后放入自动QuEChERS前处理仪器中开始处理，经25 min交替震荡离心后，从内管中取净化液过0.22μm的有机微孔滤膜，滤液供LC-MS/MS测定。同时取空白生牛乳样品，按照上述前处理操作制备样品空白提取液，用于配制基质混合标准工作溶液。

1.2.6 加标回收试验

在空白样品中添加混合标准储备液，添加浓度为0.02、0.12、0.2 mg/kg，每个添加水平重复6次。

1.3 液相色谱-串联质谱条件

色谱柱：Phenomenex H 18（50 mm×3.00 mm，2.60μm）；柱温：40℃；流速：0.40 mL/min；进样量：2μL；流动相：A相5 mmol/L甲酸铵+0.05%甲酸水溶液、B相纯甲醇；洗脱程序：0.5～5.0 min，10%B；5.0～8.0 min，95%B；8.0～10 min，10%B。

电喷雾离子源（ESI）；雾化气流量3.00 L/min；干燥气流量15.00 L/min；DL管温度为250℃；多反应监测模式（MRM）。

2 结果与讨论

2.1 定性分析

根据国内外乳及乳制品主要农药残留的种类，本研究一共对115种农药进行了选择。在实验过程中发现水胺硫磷、杀螟硫磷、异菌脲未出现响应；根据本试验所确定的分析条件，将质量浓度均为0.4μg/mL的112种混合标准溶液进样，以保留时间定性，HPLC-M S/MS总离子流图见图1。由图1可以看出，112种化合物能在10.0 min内峰型尖锐，对称性好，出峰附近都没干扰峰，是理想的色谱检测条件。

图1 112种农药总离子流图

2.2 线性关系、回收率和精密度

通过回收率、线性、精密度对自动QuEChERS结合LC-MS/MS方法进行验证。利用生牛乳空白基质配制浓度为0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.2μg/mL的基质混合标准工作液；取空白生牛乳样品，添加农药混合标准溶液，添加水平为0.02、0.12、0.2 mg/kg，每个浓度重复6次。根据样品回收率计算公式，进而得出平均回收率和相对标准偏差。本研究以待测农药回收率在70%~120%、相对标准偏差小于15%时的最小添加浓度为定量限。112种农药的线性方程、相关系数，回收率及精密度结果见表1。

表1 112种农药的线性范围、相关系数、回收率及精密度

由上述结果可以看出，几乎所有待测农药在生牛乳中线性关系良好，相关系数在0.9990~0.9999范围内，得到的回收率均在80.24%~117.67%之间，RSD值为0.27%~14.92%，在对生牛乳112种农药检测结果中，农药的定量限为0.01mg/kg，符合痕量分析的要求。进一步表明自动QuEChERS方法结合液相色谱-串联质谱对生牛乳中农药残留检测具有可行性和通用性。

（续表1）

（续表1）

2.3 实际样品测定

本方法具有快速、简便、可操作强、准确度高的优点，可应用于生牛乳中不同种类农药同时检测的需求。2020年内从市场采集生牛乳样品260份，采用自动QuEChERS方法结合液相色谱-串联质谱对样品进行了分析检测，其中均未有农药检出，同时取空白样品进行添加回收实验，RSD值均＜15%，回收率均在70%~120%之间。结果表明，本方法能够满足大规模生牛乳中农药的筛查和定量分析。

3 结 论

本研究建立了自动QuEChERS结合液相色谱串联质谱测定生牛乳中112种农药残留的方法。农药标准溶液在0.005~0.2μg/mL质量浓度范围内呈良好线性，相关系数（r）在0.9973~0.9999范围内；在0.02、0.12、0.2 mg/kg的添加浓度下的回收率为80.24%~117.67%，相对标准偏差（RSD=6）为0.27%~14.92%，方法定量限为0.01 mg/kg。该方法保证了定性及定量结果的准确性，为生牛乳中农药检测提供了技术支撑。方法经多次验证，精密度、准确度高，线性关系好，能够满足国家对生牛乳中的农药进行大规模的筛查和定量分析。