固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿乳粉中乙基麦芽酚

时间：2024-07-28

杨东东，李实飞，林正锋，谢文强，杨雪莲，王朝政

（1.海口海关技术中心，海口 570311；2.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048；3.海南大学食品学院，海口 570228）

0 引言

乙基麦芽酚是一种增香剂，能够显著改善食品风味，广泛应用于食品行业[1-2]，但大量摄入会危害人体健康[3]，我国标准规定婴幼儿配方食品不得添加食用香料[4]。目前乙基麦芽酚的检测方法主要有气相色谱法[5-6]、气相色谱串联质谱法[7-8]、液相色谱法[9-11]、液相色谱串联质谱法[12-14]、离子色谱法[15]、电化学法[16]、光度法[17]、拉曼光谱法[18]等。乳粉中乙基麦芽酚的检测前处理过程多采用水相提取稀释净化后分析，存在检测限较高，基质效应较强等缺点[11-12]。本文采用水-醚体系对乳粉样品进行提取，经碱液反萃后采用固相萃取进行净化和浓缩后液相色谱串联质谱分析，以期建立一种灵敏度高、准确可靠的婴幼儿乳粉中乙基麦芽酚的检测方法，保障乳粉质量安全。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、甲酸、二氯甲烷均为色谱纯，美国TEDIA公司；盐酸、氢氧化钠、无水硫酸钠，均为分析纯，广州化学试剂厂；乙基麦芽酚（纯度≥99%），美国Sigma公司。

HSS T3色谱柱（150×2.1 mm,2.5 μm,美国Waters公司）；C18固相萃取柱（3 mL）美国安捷伦公司；HLB固相萃取柱（3 mL）美国Waters公司；TQD超高效液相色谱-质谱联用仪，美国Waters公司；KQ3200DE超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；MS3涡旋仪，德国IKA公司；320 R低温离心机，德国Hettich公司；Advantage A10超纯水净化仪，美国Millipore公司；Genevac EZ-2型溶剂蒸发工作站，英国SP Scientific公司。乳粉样品选用一段乳粉，市售。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理方法

称取2 g试样（精确至0.01 g），置于50 mL聚丙烯离心管中，加入5 mL温度为50℃的水，转速为3 000 r/min涡旋混匀2 min，温度40℃下超声提取15 min，超声频率为37 kHz，再加入10.0 mL叔丁基甲醚，转速3 000 r/min涡旋混匀3 min,再加入10 g无水硫酸钠除水，转速3 000 r/min涡旋混匀2 min，转速9 000 r/min离心3 min，吸取上清液5 mL转移至另一离心管中，再加入5 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液反萃，转速3 000 r/min涡旋混匀1 min后，转速3 000 r/min离心3 min，用移液器准确移取下层清液到试管中，温度40℃下用Genevac EZ2溶剂蒸发工作站浓缩20 min以除去微量的叔丁基甲醚，用盐酸调节pH值至3.0，过柱。先后加入3 mL甲醇，3 mL超纯水活化固相萃取柱，然后上样，重力过柱后，用5 mL纯水淋洗，弃去淋洗液，接着用5 mL注射器抽至净干。最后用0.9 mL甲醇洗脱，接收洗脱液后用甲醇定容至1 mL，过0.22 μm微孔滤膜，供液相色谱-质谱测定。

1.2.2 色谱-质谱条件

色谱柱为HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm,2.5 μm,Waters）；流速为0.4 mL/min；进样体积为3 μL；柱温为30℃；流动相：A相为甲醇，B相为0.05%甲酸水，梯度洗脱程序为0～2.0 min，20%A，2.0～2.1 min，20%A～80%A，2.1～4.0 min，80%A，4.0～4.1 min，,80%A～98%A，4.1～5.0 min，98%A，5.0～6.0 min，98%A～20%A。

MS条件：电喷雾正离子源(ESI+)，毛细管电压：3.0 kV，离子源温度：150℃，脱溶剂管度：350℃；雾化气：150 L/hr氮气；干燥气：650 L/hr氮气；碰撞气：氩气。扫描模式：多反应监测模式(MRM)，具体条件见表1。

表1 质谱参数

1.3 数据处理

通过Masslynx工作站及数据处理系统分析采集分析质谱图，外标法定量。试验结果采用平均值表示，每个试验平行3次，采用Excel2010进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 色谱-质谱条件的优化

本文比较了水-乙腈和水-甲醇流动相体系,发现以水-甲醇作为流动相时,乙基麦芽酚定量定性离子对的响应明显优于水-乙腈流动相体系。并在此基础上考察了甲醇-水、甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水对色谱峰的影响，发现添加甲酸后，质谱响应增强，0.05%甲酸水和0.1%甲酸水响应无显著差别，故最终采用甲醇-0.05%甲酸水作为流动相。配置1 μg/mL的乙基麦芽酚标准液于进样瓶中，采用仪器自动进样进入质谱仪，在Masslynx软件中设置质谱条件，并对标准液进行离子调谐，确定母离子(m/z为141.1)对应的最佳质谱条件，根据响应稳定、信号强度较高碎片确定定量离子对（141.1＞126.1）和定性离子对（141.1＞71.1）。

2.2 固相萃取柱的选择

固相萃取柱填料对目标物的吸附和洗脱能力有重要的影响，本实验通过配制0.1 μg/mL乙基麦芽酚水溶液，经过上柱淋洗洗脱步骤后收集洗脱液分析，考察C18柱和HLB柱对乙基麦芽酚的富集效果。结果表明C18柱回收率约为20%，HLB柱的回收率超过90%，因此本实验选用HLB柱作为富集净化柱。

2.3 固相萃取柱条件的确定

由于分取的水相液体为碱性，因此本次实验研究不同pH值是否对固相萃取柱的富集效果有影响。试验用盐酸和氢氧化钠配制系列pH(pH 1～13)的溶液。向5 mL不同pH值水溶液中添加乙基麦芽酚标准溶液10 ng，上柱，淋洗、1 mL甲醇洗脱，收集洗脱液上机分析。不同pH条件下洗脱液中的乙基麦芽酚回收率见图1，由图可知，在酸性及中性的条件下，HLB柱可实现对乙基麦芽酚的富集，在碱性条件下，HLB柱对乙基麦芽酚的富集效果十分不理想，这是由于乙基麦芽酚呈弱酸性，在碱性条件下发生离子化使其在HLB柱上的吸附变弱。因此在取出碱性液体后，需要用盐酸调节pH值至酸性条件，再进行过柱净化。

图1 不同pH值标样固相萃取回收率情况

然而，在实际样品检测过程中，样品经过前处理过程后，取出含有标样的碱液5 mL，经HCl调节pH值至3.0后，过柱，洗脱后回收率低于20%，于是收集过柱液、淋洗液、洗脱液分别进行测定，结果发现过柱液和淋洗液中含有大量的乙基麦芽酚。这是由于碱液中含有微量的叔丁基甲醚，其在上样和淋洗过程中会带出乙基麦芽酚。本实验尝试采用二氯甲烷萃取除去水中微量叔丁基甲醚及通过剂蒸发工作站除去叔丁基甲醚两种方式处理，再取水相调节pH后过柱，各阶段溶液中乙基麦芽酚含量见表2，结果表明，经过二氯甲烷萃取过后的水相在过柱时不会有乙基麦芽酚损失，但是在淋洗过程仍有大量目标物会随着水进入到淋洗液中，而采用溶剂蒸发工作站除去叔丁基甲醚后，仅在洗脱液中有乙基麦芽酚，回收率超过90%，故最终实验选择先用溶剂蒸发工作站除去叔丁基甲醚后再进行固相萃取柱净化和浓缩。在此条件下，对应的样品和加标样品谱图见图2。

表2 样品过柱过程各阶段溶液中乙基麦芽酚含量

图2 标准溶液和乳粉样品MRM图

2.4 基质效应

采用液质联用分析复杂基质时通常存在基质效应，基质效应对液质检测有重要影响[19]，因此需要考察本方法的基质效应。以甲醇溶剂和空白基质配制2～100 ng/mL标准曲线，根据两条曲线的斜率计算基质效应，基质效应（ME）=（1-空白基质配制配制标准曲线的斜率/溶剂配制标准曲线的斜率）×100%[20]。空白基质配制配制标准曲线方程为：Y=205.01X+196.67，溶剂配制标准曲线的方程为Y=179.53X+101.23，基质效应为12.5%。说明乳粉基质对乙基麦芽酚有基质抑制效应，基质效应微弱。本实验基质效应远低于宁宵等采用的净化方法，这可能是由于本方法采用有机溶剂提取，可除去大量的水溶性物质，大大降低基质效应。

2.5 线性范围和定量限

以空白基质液配制系列标准溶液，（质量浓度范围为2.0～100 ng/mL），在本方法所确定的实验条件下进行分析，以峰面积为纵坐标，标准工作液质量浓度为横坐标作图建立标准曲线，线性方程为:Y=205.01X+196.67，相关系数大于0.999。根据10倍信噪比，并计入试样量和定容体积，计算定量限，定量限为2.0 μg/kg。