牛初乳生长因子粗提物修复溃疡性结肠炎的研究

刘宾，王晓明，曹凤波，周晶，霍贵成，杨丽杰

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

0 引言

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis,UC）是未知病因的急性和慢性炎性肠疾病，通常表现为出血性痢疾、腹泻，形态学上表现为炎症、病灶处溃疡、结肠黏膜隐窝被破坏。生长因子被认为能够对UC治疗有益，已经证明生长因子能够保护和修复肠道上皮细胞[1-3]。大量实验证明外源生长因子，如转化生长因子[3]、胰岛素样生长因子[4]、血小板衍生生长因子[5]，都能对结肠炎有显著地治疗作用。

牛初乳中含有大量生长因子，如类胰岛素生长因子、转化生长因子、上皮生长因子、成纤维生长因子等。本研究通过浓缩牛初乳中多种生长因子混合物灌胃溃疡性结肠炎大鼠，研究牛初乳生长因子粗提物对肠粘膜损伤的SD大鼠表象特征、形态学、病理组织以及血液中二胺氧化酶和D-乳酸的影响，旨在证实牛初乳生长因子粗提物能够修复愈合损伤肠道黏膜。

1 实验

1.1 材料和仪器

牛初乳由黑龙江完达山松北牧场提供；健康Sprague-Dawley（SD）大鼠（清洁级）45只，雄性，体重质量（300±30）g，动物购进后在本校生命院动物房饲养适应一周后投入实验，保持饲养环境温度（23±2）℃，每天人工灯光照明12 h，标准小鼠饲料喂养，自由饮水；大鼠二胺氧化酶（DAO）酶联免疫试剂盒，大鼠D-乳酸酶联免疫试剂盒。

低速离心机LD4-2；300 Ku、100 Ku陶瓷膜超滤仪；AE-30型倒置生物显微镜；Model 680型酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 牛初乳生长因子粗提物的提取

将健康母牛分娩后2 d内的牛初乳，过滤除杂，离心脱脂（7 000 g，15 min，4 ℃），小心地去除上层脂肪，用浓度为10 mol/L的HCL调节pH值至2.5[6]，18 h后再用10 mol/L NaOH调节到pH4.6，尽可能使初乳生长因子结合蛋白释放出来，4℃，10 000 g，30 min离心，收集乳清。

乳清用300 ku和100 ku陶瓷膜超滤仪进行超滤，操作压力0.15 MPa，流量5 L/h，取膜下超滤渗透液。将所得的提取液进行脱盐处理，采用3500 u的透析袋，将所得产物冷冻干燥后贮存，即为生长因子粗提物。

1.2.2 动物模型的建立

（1）动物分组。将48只SD雄性大鼠（300 g±30 g）随机分成4组，每组个12只，即正常对照组（对照组）、MTX模型组（模型组）、牛初乳生长因子粗提取物-MTX治疗组（治疗组）、柳氮磺胺吡啶（SASP组）。

（2）大鼠肠炎模型建立。正常对照组饮用蒸馏水，其余3组大鼠自由饮用蒸馏水配制的5%DSS溶液7 d，参照Cooper[7]等的方法建立大鼠UC模型。

建模后，SASP组和治疗组按照成人药量的0.018倍药量溶于2 mL饮用水后灌胃，连续灌胃7 d，每天1次进行干预。分别在造模后第3、5和7天处死大鼠，进行指标分析。

1.2.3 大鼠的表象观测

在大鼠灌胃期间，每天观察并记录各组大鼠生长状态，包括进食情况、外观毛发、粪便形态和体重。实验过程第3、5和7天时，根据动物疾病活动指数（DAI）[8]，结合动物的体质量下降百分率（体质量不变为0，1～5为1分，5～10为2分，10～15为3分，大于15为4分）、大便黏稠度（正常为0.松散的大便为2分，腹泻为4分）和大便出血（正常0分，隐血阳性为2分，显性出血为4分）三种情况进行综合评分。将3项结果的总分除以3即得到DAI值。死亡的计为4分。

1.2.4 病理组织学分析大鼠肠黏膜组织

将大鼠肛门至盲肠末端的整个结肠和直肠端快速取出，并用等压生理盐水清洗，定长取出末端结肠，用光滑玻璃棒刮下黏膜，分别收集结肠和黏膜称重。

将结肠末端组织，生理盐水冲洗肠腔，然后固定于10%中性福尔马林溶液中，常规脱水，用二甲苯观察组织块至透明为止，石蜡包埋，切片机切片，置水槽中展片、捞片和贴片，约6 μ m厚，HE染色后光镜下组织学检查。参考Park等[9]标准，根据肠组织固有层分离、中性粒细胞浸润，绒毛脱落、坏死，血管扩张，间质水肿，分为0～8级：0级，正常黏膜、组织结构正常；l级，绒毛顶部上皮下产生间隙或固有层分离；2级，上皮下间隙扩大；3级，上皮部分绒毛脱落；4级，绒毛脱落明显；5级，绒毛消失伴随坏死；6级，隐窝组织形成梗死；7级，转化粘液质形成梗死；8级，透壁梗死。

1.2.5 大鼠血浆二胺氧化酶（DAO）活性的测定

按试剂盒说明书要求严格操作。

1.2.6 大鼠血浆D-乳酸水平的测定

按试剂盒说明书要求严格操作。

1.2.7 统计学分析

所有结果均经SPSS 13.0统计软件分析。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采Duncan法：两组间比较采用两独立样本的t检验。结果以均数±标准差表示，P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果与讨论

2.1 初乳生长因子粗提物对肠道损伤大鼠表象的影响

模型组大鼠饮用DSS造成大鼠溃疡性结肠炎后，进食量明显减少，行动迟缓，毛发无光泽，出现水样稀便、脓血便。对照组食量正常，体重明显增加，大便成颗粒状。5 d后逐渐好转，体重逐渐增加，脓血便消失，仍然出现倦怠、稀便。第7天时，体重恢复到初始水平，粪便基本成型。治疗组和SASP组大鼠，在灌胃初乳生长因子粗提物3 d后，体重已经开始增加，进食量增加，排便次数减少，血便减少。第5 d时，体重已经恢复到初始体重，粪便开始成型，活动量增加。7 d时，已经与正常对照组无明显差异。由表1看出，第3、5天时，治疗组与SASP组的DAI评分都显著高于对照组评分，也均显著低于模型对照组评分，但是治疗组与SASP之间无显著性差异（P=0.521,1.000）。第7天时，治疗组和SASP组与对照组无显著性差异（P=0.280），而仍与模型组大鼠DAI评分呈显著性差异，说明初乳生长因子能加速治疗大鼠溃疡性结肠炎。

表1 溃疡性结肠炎大鼠DAI和Park评分比较

2.2 肠粘膜组织学形态观察

由图1可知，正常对照组小鼠直结肠组织见腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞无减少，未见黏膜糜烂、出血。模型组大鼠结肠上皮细胞明显萎缩，绒毛变钝，甚至消失，且伴随着多孔性带有液泡的细胞出现。治疗组和SASP组大鼠结肠表现出较轻的症状，保持了较完整的黏膜结构，绒毛缺失较少，隐窝开始重塑，无炎性细胞浸润。由表1可知，治疗组与SASP组在第3天的Park评分显著高于对照组，也均显著低于模型组，而治疗组与SASP组之间无显著性差异（P=0.073），而第7天时，治疗组和SASP组的Park评分与对照组无显著性差异（P=0.146），而治疗组和SASP组与模型组呈显著性差异。说明初乳生长因子粗提物对大鼠溃疡性结肠炎有治疗作用。

图1 大鼠肠道组织学变化（HE,×100）

2.3 结肠外观形态观察

图2为牛初乳生长因子粗提物对结肠及其黏膜的影响。由图2可以看出，与对照组相比，在第3天时，治疗组与SASP组结肠的质量都显著下降，分别下降28.28%和28.39%，结肠黏膜的质量下降更为显著，分别下降了36.57%和27.69%，模型组结肠及其黏膜质量下降更为显著，治疗组与SASP组之间无显著性差异。第5天时，模型组和治疗组结肠与结肠粘膜的质量仍然显著低于对照组，但明显增加。第7天时，治疗组和SASP组结肠和结肠黏膜质量已经与对照组无显著性差异（P=0.09,P=0.462），而模型组仍与对照组呈显著性差异。

图2 对结肠的影响

图3 对结肠黏膜的影响

2.4 血浆二胺氧化酶（DAO）活性

图3为牛初乳生长因子粗提物对大鼠血浆DAO活性的影响。由图3可以看出，第3天和第7天时，治疗组和SASP组DAO活性明显高于对照组，显著性低于模型组，且治疗组与SASP组DAO活性也呈显著性差异。第7天，治疗组和SASP组DAO活性大幅度下降，仍显著高于对照组，但是显著低于模型组DAO活性，此时，治疗组和SASP组DAO活性无显著性差异（p=0.110）。说明初乳生长因子粗提物能够加快修复溃疡性结肠炎肠道。

图4 对大鼠血浆DAO活性的影响

2.5 血浆D-乳酸水平

图4为牛初乳生长因子粗提物对大鼠血浆D-乳酸质量浓度的影响。由表4可以看出，第3天和第5天治疗组和SASP组血浆中D-乳酸浓度显著高于对照组，显著低于模型组，而且治疗组与SASP组呈显著性差异。第7天时，治疗组和SASP组D-乳酸质量浓度大幅度下降，分别下降了35.25%与51.71%，与模型组呈显著性差异，而且治疗组和SASP组D-乳酸质量浓度仍与对照组成显著性差异。说明初乳生长因子粗提物能显著加快受损溃疡性结肠黏膜修复和愈合。

图5 对大鼠血浆D-乳酸质量浓度的影响

2.6 讨 论

大量研究结果显示溃结溃疡性结肠炎的发生是多方面因素共同作用的结果，溃疡性结肠炎的溃疡的愈合过程极为复杂，其愈合过程包括清除溃疡后所形成的变性坏死的结肠组织，溃疡基底部肉芽组织增生，溃疡处新生的毛细血管和血管生成，进而溃疡处纤维结缔组织增生及溃疡处瘢痕组织的形成，溃疡周围结肠上皮的单层柱状上皮长入等过程[10]。

溃疡愈合受到各种调控因子和细胞参与。Tarnawski[11]等动物实验研究结果显示在EGF的调控下，溃疡性结肠炎的溃疡组织瘫痕的上皮化和结肠组织肠腺结构的重建过程才得以完成。Luck等[12]对小鼠溃疡性结肠炎模型体内注射EGF连续7d，结果发现EGF能明显减轻结肠的溃疡和炎症。肌肉注射EGF能减轻大鼠乙酸性结肠炎的黏膜损伤指数，减少炎症时产生的过氧化脂质（LPO）、髓过氧化物酶（MPO），预防修复结肠损伤，对肠黏膜细胞具有保护作用[13]。实验研究发现，初乳生长因子粗提物能够降低DAI和Park分数，大鼠进食量增加、体重、活动量逐渐增加，粪便成块，毛发变亮，第7天时，治疗组DAI评分已经与对照组无显著性差异，而模型组仍有显著的炎症性症状。

炎症性肠道疾病是由于肠道黏膜屏障功能遭到破坏，恢复和改善肠道功能是治疗的炎症肠道疾病的目标本之一[14]。光镜下对大鼠结肠切片观察发现，第3天模型组大鼠肠黏膜严重损坏，绒毛变钝，隐窝破坏并伴随着明显的肠腔多空，上皮细胞出现液泡，第5天时，治疗组大鼠隐窝开始重塑，绒毛再生，绒毛间隙紧密。第7天时，肠绒毛高度增长、紧密排列，隐窝完整，与对照组无显著性差异，说明初乳生长因子粗提物对溃疡性结肠炎具有治疗修复作用。

TGF-α和TGF-β2已经被证实能显著增加损伤空肠和回肠及其黏膜质量[15,16]。本实验对结肠及其黏膜进行分离称重，结果表明溃疡性结肠炎大鼠的结肠及其黏膜重量明显下降，模型组大鼠结肠和黏膜重量下降了接近对照组一半。灌胃初乳生长因子粗提物3天后，治疗组大鼠结肠及其黏膜重量已经显著增加，与模型组呈显著性差异。第7天，治疗组已经与对照组无显著性差异，说明治疗组大鼠溃疡性结肠炎已经治愈，表明初乳生长因子粗提物还能够加速修复损伤的溃疡性结肠炎。

DAO是人类和哺乳动物肠黏膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，其活性与小肠绒毛高度和黏膜细胞的核酸和蛋白质的合成密切相关，是肠黏膜细胞的标志酶，约95%存在于哺乳动物小肠绒毛上层，在共他组织中则含量少、活性低[17]。生理状况下血浆中DAO活性很低。在肠黏膜受损时，由肠黏膜细胞释放的DAO大量入血，使血中浓度大幅上升，反映小肠黏膜结构和功能的完整性和损伤程度。D-乳酸是肠道内细菌发酵产生的一种物质，哺乳动物组织不产生D-乳酸，且缺乏代谢该物质的酶系统，不能代谢该物质。在肠黏膜屏障正常时，血浆D-乳酸极低，只有当肠黏膜屏障受破坏时，D-乳酸透过肠过肠黏膜屏障入血，使血浆D-乳酸快速升高。因此，血浆D-乳酸水平可间接反映肠黏膜屏障功能，可作为肠道黏膜损伤指标之一。实验中，灌胃牛初乳生长因子粗提物3d后，治疗组大鼠的DAO活性和D-乳酸质量浓度显著下降，已经与模型组呈显著性差异。第7天后，治疗组DAO活性和D-乳酸质量浓度大幅度下降，而与模型组呈显著性差异，但与SASP组无显著性差异，说明初乳生长因子对溃疡性结肠炎有明显的治疗效果。

3 结论

本研究证实牛初乳生长因子粗提物能够降低溃疡性结肠炎大鼠的DAI和Park评分，维持结肠组织形态完整性，增加结肠及其黏膜质量，增加结肠组织绒毛长度及隐窝深度，加大吸收面积。能使血浆中DAO活性及D-乳酸质量浓度降低，愈合损伤的结肠肠道，维持了肠道完整性，通透性肠道降低。因此初乳生长因子粗提物具有治疗和改善结肠损伤的功能。

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