嗜热链球菌关键生产特性分子水平的研究进展

赵春雨，崔艳华，曲晓军，俞婷，张春玲

（1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨150090；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010）

0 引言

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是最具经济价值的同型发酵乳酸菌之一，是公认的益生菌，对维持人体胃肠道微生态平衡，改善乳糖不耐症，提高机体免疫力有积极功效，在世界范围内广泛应用于酸奶、瑞士干酪等发酵乳品生产[1-2]。

嗜热链球菌菌株的产酸、代谢乳糖、抗噬菌体、宿主防御能力、快速生长能力、合成胞外多糖（EPS）、产细菌素及风味物质等特性，直接关系到发酵乳品的品质特性，其中以胞外多糖合成和产酸能力最为重要[2]。研究发现，不同菌株间，存在着产酸、乳糖代谢、适应环境胁迫能力、胞外多糖与细菌素合成能力等明显的差异[3-9]。当前，嗜热链球菌的研究，大多集中于基于表型特性的菌株筛选和不同生境中菌株遗传多样性分析，而对于不同菌株间重要生产特性的分子水平研究甚少，具体机理机制更鲜有报道。本文就当前嗜热链球菌关键生产特性分子水平研究的概况作以简介，旨在为该方向研究提供参考。

1 基因组学

大量乳酸菌，尤其是嗜热链球菌不同菌株基因组序列信息的公布，加速了嗜热链球菌在分子水平上的研究。当前已完成了10余株嗜热链球菌的全基因组测序，主要为乳源性菌株，包括LMG18311、LMD-9和CNRZ1066菌株（NCBI登录号CP000023.1、CP000419.1和 CP000024.1，均来自酸奶）；MN-ZLW-002菌株（NCBI登录号CP003499.1，分离于中国传统发酵乳）；ND03菌株（NCBI登录号CP002340.1，来自青海自然发酵牦牛乳）；JIM8232菌株（NCBI登录号FR875178.1，分离于牛奶且产黄色素）；ASCC 1275菌株（NCBI登录号CP006819，高产胞外多糖）[10-15]。近期分离于山羊奶的TH1435和TH1436菌株（NCBI登录号 AYSG00000000、AYTT00000000），来自印度干酪的MTH17CL396和M17PTZA496（NCBI登录号AZJS00000000、AZJT00000000）菌株的全基因组序列也已完成[16-17]。同时CNCM I-1630、DGDD7710、MTCC5460、MTCC5461、DGCC7710等多个菌株正处于基因组测序中。多个菌株基因组序列的公布，为在分子水平上阐述该菌生理及代谢机制，加速优良菌种的选育和改造，提高发酵食品工业化控制水平，奠定了理论基础；并为从基因水平上揭示不同菌株之间生产特性差异的机制，提供了理论依据和实验参考。

2 关键发酵特性分子水平

乳源性S.thermophilus菌株具有合成胞外多糖、分解蛋白、产酸、酸耐受性、合成细菌素、利用乳糖、产甲酸和叶酸、天然和适应性免疫、抗噬菌体、生长快速等共同的特性[4,18]。这些共性对于S.thermophilus作为乳品发酵剂应用于乳发酵过程至关重要。菌株为了适应不同的环境，其基因组不断的进化，形成了各自独特的基因组成和特殊的相应调控系统，进而菌株也呈现出不同的发酵特性。

研究者对分离于乳品的47株S.thermophilus，比较基因组杂交分析，研究发现，不同菌株基因组的核心基因具有较大差异，差异基因主要包括细菌素合成、胞外多糖生物合成、肽代谢、噬菌体抗性等相关基因[18]。基因水平转移和自然竞争共同作用使得S.thermophilus在乳环境中的进化得以完成。在进化过程中，部分碳水化合物代谢基因、毒力基因等基因，在稳定的乳环境中逐渐退化和消失[6,19]。在Streptococcus属中，开放读码框架组的功能基因分布分析表明，S.thermophilus LMG18311、LMD-9和CNRZ1066菌株形成了明显的功能簇，专门适应营养丰富的乳环境[19]。

同时，蛋白分解能力、氮代谢、糖利用和转运系统，在菌株适应乳环境的过程中，起到了关键作用[4,6,18]。这种进化导致了菌株多样的代谢活性[3-9]。

2.1 胞外多糖合成多样性

当前，在S.thermophilus已经发现了15种胞外多糖合成基因簇和67种糖基转移酶[7,15]。eps基因簇多样性可能直接影响了菌株产胞外多糖的能力。

分离于传统发酵乳品的S.thermophilus MNZLW-002菌株具有显著的产胞外多糖能力，并表现出良好的发酵性能[14]。研究发现，MN-ZLW-002中的胞外多糖合成（eps）基因簇与其他菌株中的eps基因簇不尽相同。MN-ZLW-002菌株的eps基因簇，由20,358 bp组成，含有25个开放读码框（Open Reading Frame,ORF），其中epsA、epsB、epsC和epsE等四个基因为胞外多糖合成相关的保守基因。有趣的是，该菌eps基因簇中含有9个转座酶基因，是目前发现的含有最多转座酶基因的S.thermophilus eps基因簇[10-15]。推测该基因簇可能是通过种间基因水平转移获得的。

近来基因组分析发现，具有高产胞外多糖性能的ASCC 1275菌株，与其他已测序的S.thermophilus菌株（LMD-9、 CNRZ1066、 LMG 18311、 ND03、MN-ZLW-002）相比，含有独特的胞外多糖生物合成系统，具有高度保守的胞外多糖生物合成调控基因epsA-epsB，但是eps基因簇的组成与其他菌株较为不同。在其eps基因簇中有2对基因，即eps1C-eps1D和eps2C-eps2D，决定着EPS链的长度。同时表明该菌株可以生产不同分子量的胞外多糖。同时该菌具有更有效的蛋白分解系统及更为复杂的压力反应系统。ASCC 1275菌株含有4个独立的CRISPR/Cas后天免疫系统，该系统用于消灭外来的噬菌体。该菌株是当前发现的含有该系统最多的S.thermophilus菌株。这一特性是该菌株在工业生产上发挥效能的有力保障[10-12,14-15]。

2.2 风味多样性

在乳制品发酵过程中，乳酸菌对于风味物质的形成起到了关键作用。在乳中风味物质的前体物质主要来自酪蛋白，同时也来自脂肪酸和糖类。乳酸菌的蛋白酶系统将酪蛋白降解成氨基酸，后者被胞内酶作用转化成醇类、醛类、酯类等物质，从而形成乳品特有的风味[20]。

由蛋白分解产生的游离的氨基酸，通过氨基酸途径，转化成多样的风味物质。支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）、芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）、含硫氨基酸（甲硫氨酸、半胱氨酸）是风味物质的主要氨基酸来源。这些氨基酸主要通过转氨和脱氨途径，转化成风味物质[20-23]。转氨途径中，氨基酸在氨基转移酶的作用下，转化成相应的α-酮酸，α-酮酸进而转成醛、醇和酯等重要的芳香物质。研究表明支链氨基酸、芳香族氨基酸和甲硫氨酸经转氨途径代谢。

嗜热链球菌的CNRZ1066、LMG18311和LMD-9菌株，全基因组分析表明，α-酮酸转化的关键途径—氧化脱羧途径的ptb、buk、bkdDABC的同源基因位于嗜热链球菌染色体的不同位置上，而非位于同一个操纵子上。当前已研究证实嗜热链球菌菌株具有这些酶的活性[24]。大多数嗜热链球菌菌株生长在基本培养基中，没有对氨基酸（包括含硫氨基酸）的需求，表明其含有氨基酸生物合成的全部途径[25]。基因组分析也证实了这一点。该菌基因组中含有丝氨酸乙酰基转移酶（CysE）、半胱氨酸合成酶（CysK）、胱硫醚-β-合成酶（CBS）、S-甲基转移酶MetH和MetE等一系列氨基酸生物合成的相关酶[10-11,20]。有趣的是，嗜热链球菌基因组中含有2个CysE，而大多数乳杆菌中不含该酶。该酶可催化丝氨酸生成o-乙酰基-L-丝氨酸，后者在CysK作用下，生成半胱氨酸，进而形成二甲基硫醚等重要的芳香物质[20]。

2.3 细菌素合成多样性

当前，已经对嗜热链球菌的抗菌性和抗菌谱展开了较为广泛的研究。研究表明，该菌有的菌株产生细菌素，并且抗菌谱存在差异。嗜热链球菌产生的细菌素thermophilins可以抑制病原菌和腐败细菌，例如李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）等。许多细菌素已经被纯化、测序和功能验证[9,26-30]。研究发现，由thmA和thmB基因编码的二肽细菌素thermophilin 13，以及tepA基因编码的羊毛硫抗菌肽thermophilin 1277，表现出广谱的抗菌能力[26,29]。

2.4 蛋白酶多样性

在发酵乳的生产过程中，由于牛乳中游离氨基酸的含量较低，从而限制了乳酸菌的生长，因此乳酸菌发酵剂菌株必须将酪蛋白降解为肽类和氨基酸，以满足其快速生长对含氮源的需求。蛋白水解系统为细胞提供生长所需的基本的氨基酸，同时影响着发酵乳品的感官特性和风味[30]。乳酸菌的蛋白水解系统主要含有三个组分：（1）胞外蛋白酶，将酪蛋白降解成寡肽；（2）肽转运系统，将肽运输到细胞中；（3）胞内肽酶，将肽降解成更短的肽和氨基酸[31]。酪蛋白中含有丰富的脯氨酸，因此乳酸菌含有大量的脯氨酸肽酶[32-33]。

当前，在乳酸菌中已经发现了5种类型的胞外蛋白酶，包括PrtP（Lactococcus lactis、Lactobacillus paracasei）、PrtH（Lactobacillus helveticus）、PrtR（Lactobacillus rhamnosus）、PrtS（S.thermophilus）、PrtB（Lactobacillu delbrueckii ssp.bulgaricus）[30]。不同乳酸菌蛋白水解活性存在明显差异，例如与 L.delbrueckii ssp.bulgaricus、L.acidophilus、Bixdobacterium spp.相比，S.thermophilus具有更高的二肽酶活性[34-35]。同时，同一菌种的不同菌株之间蛋白水解活性也表现出较大差异[6,36-37]。Galia等人研究发现，在30个供试的S.thermophilus菌株中，12个株菌具有胞外酶活性（PrtS+），3株表现出微弱胞外酶活性（PrtS+/-），而15株菌无胞外酶活性（PrtS-）[6]。有趣的是，PrtS-菌株却含有编码PrtS的基因，因此推测可能由于prtS调节的变化，而导致了菌株缺乏蛋白水解能力。同时研究表明，具有高度酸化能力的菌株，均为PrtS+菌株。绝大多数PrtS+菌株在系统发育进化中，关系密切。采用16S-23S rDNA内转录间隔区测序分析表明，具有高度酸化能力和蛋白水解能力的菌株，均为II-ITS型[6]。

3 结束语

嗜热链球菌合成胞外多糖、产细菌素、蛋白酶及风味物质等重要生产特性，与发酵乳品质密切相关。不同菌株之间存在着生产特性的明显差异，解析生产特性差异的机制，将为加快优良菌株的选育和改造、加速优良发酵剂生产、提高发酵食品工业化控制水平提供理论依据。近年来，基因组学、蛋白质组学中研究新方法和新技术手段的出现，将加快这一进程。

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