动物源性食品中抗司帕沙星单克隆抗体的研制与鉴定

曹德玉，郭淼，贾国超，胡骁飞，王方雨，刘珍，杨幸东，张改平

（1.周口职业技术学院生物工程系，河南周口466000；2.河南省农业科学院，农业部动物免疫学重点实验室，河南省动物免疫学重点实验室，郑州450002；3.南阳农业职业学院农学系，河南南阳474150）

动物源性食品中抗司帕沙星单克隆抗体的研制与鉴定

曹德玉1，2，郭淼3，贾国超2，胡骁飞2，王方雨2，刘珍2，杨幸东2，张改平2

（1.周口职业技术学院生物工程系，河南周口466000；2.河南省农业科学院，农业部动物免疫学重点实验室，河南省动物免疫学重点实验室，郑州450002；3.南阳农业职业学院农学系，河南南阳474150）

为了制备高灵敏、高特异性的司帕沙星（SPFX）单克隆抗体，鉴定免疫学特性。采用蛋白质偶联技术DCC法制备免疫抗原SPFX-BSA和包被抗原SPFX-OVA，免疫BALB/c小鼠，用间接ELISA和阻断ELISA选出产生优质多克隆抗体的的小鼠进行细胞融合，经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗SPFX单克隆抗体的杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法制备抗SPFX的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明，间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠效价均达1.28:104以上，融合后筛选出四株杂交瘤细胞株4H 4-C8，4H 4-C4，4H 4-B1和4H 4-E9；其细胞上清效价分别为1:1.4×103，1:8.0×102，1:5.0×102，1:6.7×102；4H 4-C8株腹水效价为1: 2.6×106，抗SPFX的单克隆抗体对SPFX的IC50为31μg/L，且具有较好的特异性。本研究成功合成SPFX人工抗原，制备出优质的单克隆抗体，为SPFX免疫学快速检测方法的建立奠定坚实的基础。

司帕沙星；人工抗原；单克隆抗体；免疫学特性

0 引 言

司帕沙星SPFX因其疗效好、廉价易得等特点而在兽医临床上得到广泛应用[1]。而该类药物的滥用导致的残留问题引起人们的重视[2-3]。目前美国禁止SPFX在家禽上使用；我国农业部制定肉品中SPFX最大残留限量为100μg/kg[7]，目前相关检测方法主要有HPLC等理化方法[4-8]，难以满足快速、简便的现场检测要求，故亟待建立相应的SPFX检测方法，对其使用有效监控，减少其对人类和环境的危害。国内外已有相关药物ELISA方法的研究[9-21]，而国内少有SPFX单抗研制报道。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的抗体尤其是具有均一性和永续性的单克隆单体是免疫学检测的前提[22-23]。故本研究利用合成人工抗原免疫小鼠，通过杂交瘤技术制备SPFX的单克隆抗体，为SPFX免疫学快速检测方法的建立奠定坚实基础。

1 实 验

1.1 材料

1.1.1 试剂与溶液

司帕沙星沙星（纯度≥99.2%），牛血清白蛋白（BSA），鸡卵清蛋白（OVA），弗氏完全佐剂（FCA），弗氏不完全佐剂（FIA），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），N，N-二环己基碳二亚胺（DCC），羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP），四甲基联苯胺（TMB），其他试剂均为AR级。

洗液（PBST）：含体积分数0.05%的Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS，浓度0.01mol/L，pH值为7.4）；包被液（CBS）：浓度0.05 mol/L（pH值为9.6）的碳酸盐缓冲液；间接ELISA和阻断ELISA所用的封闭液：含质量浓度50 mL/L猪血清的PBST；TMD底物缓冲液：TM B的醋酸-柠檬酸缓冲液；终止液：2 mol/L的硫酸溶液。

1.1.2 主要仪器

550型酶标仪，93-3定时恒温双向磁力搅拌器，U-3000紫外扫描仪（UV），超净工作台，3K-18高速冷冻离心机，AE260电子天平，倒置生物显微镜，96孔、24孔细胞培养板，3701型CO 2培养箱。

1.1.3 实验动物

6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心，由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室饲养。

1.2 人工抗原的合成与鉴定

参考贾国超等[24]介绍的方法，采用蛋白质偶联技术DCC法合成免疫原SPFX-BSA，合成路线如图1所示。同理合成包被原SPFX-OVA。用UV和SDS-PAGE电泳鉴定人工抗原偶联情况。

图1 DCC法制备SPFX人工抗原路线

1.3 动物免疫

取6～8周龄BALB/c雌性小鼠6只，背部皮下多点注射免疫，免疫剂量30μg/只，共免疫4次。首免，稀释后SPFX-BSA与等量FCA混合，在转速为40 000 r/min下乳化10 min；其他3次免疫采用稀释后SPFX-BSA与等量FIA混合，转速为40000 r/min充分乳化10 min。第四次免疫10 d后，断尾采血并分离血清待检测。

1.4 杂交瘤细胞株的建立

1.4.1 细胞融合

在PEG的作用下，将NS0骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶5比例融合，然后置于37℃，质量分数为5%的CO2培养箱中进行培养，次日检查有无污染，5 d后换液，8 d后检测细胞上清筛选阳性孔。

1.4.2 杂交瘤细胞的筛选

融合细胞培养后，用间接ELISA和阻断ELISA法筛选出阳性强、特异性好、细胞生长旺盛的孔进行多次亚克隆直至所有克隆鉴定结果一致。

1.4.3 SPFX单克隆抗体（SPFX mAb）的大量制备

采用体内诱生腹水法生产SPFX单克隆抗体[24]。取BALB/c小鼠，腹腔注入灭菌液体石蜡0.5 mL，7～10 d后注入克隆化阳性杂交瘤细胞，经抽取腹水、纯化抗体等步骤后，测定单克隆抗体含量。

1.5 单克隆抗体免疫学特性的鉴定

（1）效价的鉴定采用间接ELISA测定细胞上清和mAb效价。

（2）敏感性鉴定采用阻断ELISA测定m Ab对SPFX的抑制率。

（3）特异性的鉴定采用以SPFX的同系物和其他竞争物作为抑制剂来测定其交叉反应率。

（4）亚型鉴定采用间接竞争ELISA检测方法，具体步骤按照单克隆抗体亚型检测试剂盒的说明书进行操作。

2 结果与分析

2.1 小鼠免疫试验

经免疫，6只小鼠均产生SPFX多克隆抗体，效价达到1.28×104以上（图2），说明BSA-SPFX取得预期免疫效果，其中3号小鼠血清效价最高。

图2 BALB/c小鼠多抗血清效价

2.2 单克隆抗体免疫学特性的鉴定

2.2.1 效价测定结果

筛选出4株优质杂交瘤细胞株，命名为为4H 4-C8，4H 4-C4，4H 4-B1，4H 4-E9；其中4H 4-C8细胞株的上清效价最高，其诱生腹水效价为1∶2.6× 106。

表1 SPFX mAb的间接ELISA效价测定

2.2.2 敏感性测定结果

将4H 4-C 8株单克隆抗体腹水敏感性在半对数坐标轴上绘成抑制曲线，结果见图3，线性回归方程为y=-0.3321x+0.9953，R2=0.9827，其对SPFX的IC50可以达到31μg/L，敏感性高。

图3 单抗4H 4-C8对SPFX的抑制曲线

2.2.3 单克隆抗体亚型的测定结果

按亚型检测试剂盒的说明书进行鉴定，结果如图4所示。图4中单抗的亚型为IgG 1型。

图4 SPFXmAb抗体亚型

2.2.4 特异性的测定结果

SPFX mAb的IC50为31μg/L。由表2可以看出，与同系物的交叉反应率小于3.73%，与其他竞争物的交叉反应率小于0.15%，结果证明本研究获得特异性较强的的SPFX单克隆抗体。

表2 SPFX mAb与其他化合物的交叉反应

3 讨 论

3.1 SPFX人工抗原的制备

免疫学快速检测法相对HPLC等传统理化检测方法，具有灵敏、特异、操作简单、质优价廉等优点，是未来快速检测及大批量现场检测发展的主要方向。制备优质免疫原是建立免疫学检测方法的基础。SPFX是分子量为392.41 u，属小分子药物，与BSA、OVA等大分子蛋白偶联后才能具有免疫原性和反应原性，进而激发动物免疫系统产生相应抗体。本研究在DCC的作用下将SPFX上的羧基在DCC的作用下与NHS反应生成中间产物，然后与载体蛋白上的氨基反应形成具有免疫原性的人工合成抗原，避免了蛋白分子间的交联，提高了偶联成功概率。

3.2 单克隆抗体的生产

本研究仍采用体内诱生法来诱生单克隆抗体，具有廉价、高效等特点。接种杂交瘤细胞前小鼠进行腹腔石蜡注射，有效抑制小鼠巨噬细胞和淋巴细胞的免疫功能，提高小鼠腹腔接纳杂交瘤的能力；11 d后收集腹水，获得较好的效果。

4 结 论

本研究利用蛋白质偶联技术合成的免疫原SPFX-BSA免疫小鼠获得多抗血清，应用细胞融合和杂交瘤细胞筛选技术，获得优质杂交瘤细胞株，通过体内诱生腹水法制备大量单克隆抗体，经免疫学特性鉴定，所制备的抗SPFX单克隆抗体敏感性高，特异性强，IC50最低达到31μg/L，为SPFX免疫学快速检测方法建立及相应检测产品开发奠定了坚实的基础。

[1]ETHAN R.Safety profile of sparfloxacin in the treatment of respiratory tract infections[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，1996，37（1）：145-160.

[2]JONES S C，SORBELL O A，BOUCHER R M，et al.Fluoroquinolone-Associated myasthenia gravis exacerbation：evaluation of postmar keting reports from the US FDA adverse event reporting system and a literature review[J].Drug Safety，2011，34（10）：839-847.

[3]PUGI A，LONGO L，PUGI A，et al.Cardiovascular and metabolic safety profiles of the fluoroquinolones[J].Expert Opinion on Drug Safety，2012，11（1）：53-69.

[4]翟海云，谭学才.司帕沙星的毛细管电泳高频电导法测定[J].分析试验室，2004，23（11）：26-29.

[5]GUL S，SULTANA N.New method for optimization and simultaneous determination of sparfloxacin and non steroidal anti-inflammatory drugs：itsin-vitro application[J].American Journal of Analytical Chemistry，2012，3（4）：328-337.

[6]万雄，郁迪，董洁莹，等.离子液体萃取/HPLC测定水产品中司帕沙星残留研究[J].食品科技，2012，37（5）：303-306.

[7]LI Y L，HAO X L，JIB Q，et al.Rapid determination of 19 quinolone residues in spiked fish and pig muscle by HPLC tandem mass spectrometry[J].Food Additive Contaminants，2009，26（3）：306-313.

[8]XU H Y，CHE LG，LEIS，et al.Microwave-assisted extraction and in situ clean up for the determination of fluoroquinolone antibiotics inchicken breast muscle by LC-MS/MS[J].Journal of Separation Science，2011，34（2）：142-149.

[9]SHENGW，XU T，MA H，et al.Development of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of danofloxacin residues in beef，chicken and pork meats[J].Food and Agricultural Immunology，2009，20，35-47.

[10]WANG Z，ZHU Y，DING S，et al.Development of a monoclonal antibody-based broad-specificity ELISA for fluoroquinolone antibiotics in foods and molecular modeling studies of cross-reactive compounds[J].Analtical Chemisty，2007，79，4471-4483.

[11]HUET A C，CHARLIER C，TITTLEMIER SA，et al.Simultaneo us determination of fluoroquinolone antibiotics in kidney，marine products，eggs，and muscle by enzyme-linked immunosorbent assay[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54，2822-2827.

[12]SHENG W，XIA X F，WEI K Y，et al.Determination of marbofloxacin residues in beef and pork with an enzyme-linked immunosorbent assay[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57，5971-5975.

[13]LU S G，ZHANG Y L，LIU G T，et al.Preparation of anti-pefloxacin antibody and development of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of pefloxacin residue in chicken liver[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54，6995-7000.

[14]WANG Y，SHEN Y D，XU Z L，et al.Production and identification of monoclonal antibody against flumequine and development of indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry，2010，38，313-317.

[15]JIANG J Q，ZHANG H T，ZHAO H Z，et al.Development and optimization of amAb-based indirect competitive ELISA for enrofloxacin residue in duck[J].Applied Mechanics and Materials，2011，48，423-427.

[16]JAHN C，SCHWACK W.Determination of cutin-bound residues of Sparfloxacin by immunoassay[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49（3）：1233-1238.

[17]ZHANG H T，JIANG J Q，WANG Z L，et al.Development of an indirect competitive ELISA for simultaneous detection of enrofloxacin and ciprofloxacin[J].Journal of Zhejiang University Science B，2011，12，884-891.

[18]LIU Y Z，ZHAO G X，WANG P，et al.Production of the broad specific monoclonal antibody against sarafloxacin for rapid immunoscreening of 12 fluoroquinolones in meat[J].Journal of Environmental Science and Health，2013，48，139-146.

[19]FAN G Y，YANG R S，JIANG J Q，et al.Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk[J].Journal of Zhengjiang University Science B，2012，13，545-554.

[20]SCOR TICHINI G，ANNUNZIATA L，GIROLAMO V D，et al. Validation of an enzyme linked immunosorbent assay screening for quinolones in egg，poultry muscle and feed samples[J].Analytica Chimica Acta，2009，637，273-278.

[21]JAHN C，ZORN H，PETERSEN A，et al.Structure specific detection of plant cuticle bound residues of Sparfloxacin by ELISA[J].Pesticide Science，1999，55（12）：1167-1176.

[22]职爱民，李青梅，刘庆堂，等.抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用[J].中国农业科学，2010，43（12）：2584-2589.

[23]贾国超，职爱民，宋春美，等.司帕沙星人工抗原合成及鼠源多克隆抗血清的制备[J].西北农业学报，2013，22（6）：27-30.

[24]职爱民，李青梅，刘庆堂，等.西马特罗杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体制备和鉴定[J].核农学报，2010，24（5）：1011-1014.

《中国乳品工业》杂志摘要写作要求

1 摘要写作要求

按报道性摘要书写，字数300字左右，以提供文章内容梗概为目的，不加评论及补充解释，摘要中应包括研究目的、方法及过程、结果与结论、创新性和创新点。中英文摘要内容应一致。

2 摘要写作注意事项

2.1 着重反映新内容和特别强调的观点。

2.2 排除在本学科领域已成常识的内容。

2.3 不得简单地重复题名中已有的信息。

2.4 书写要合乎语法、保持上下文的逻辑关系。

2.5 结构要严谨，表达要简明，语义要确切，不分段落。

2.6 用第三人称的写法。应采用“对……进行了研究”、“报告了……现状”、“进行了……调查”等记述方法，不要使用“本文”、“作者”等为主语。

2.7 采用规范化的名词术语（包括地方、机构名和人名）。

2.8 缩略语、略称、代号，除了相邻专业的读者也能清楚理解的以外，在首次出现处必须加以说明。

3 英文摘要写作注意事项

3.1 避免在摘要的第一句重复使用题目或题目的一部分。

3.2 用简洁、明确的语言（一般不超过150个单词），尽量用短句并避免句型单调。

3.3 描述作者的工作一般用过去时态，陈述由这些工作所得的结论时用现在时态。

3.4 尽量用主动语态代替被动语态。

3.5 尽量用语义清楚并为人熟知的词汇，对于大众熟知的缩写语可直接使用。

Preparation and identification of a monoclonal antibody against sparfloxacin in animal food

CAO De-yu1，2，GUO Miao3，JIA Guo-chao2，HU Xiao-fei2，WANG Fang-yu2，LIU Zhen2，YANG Xin-dong2，ZHANG Gai-ping2

（1.Department of Biological Engineering，Zhoukou Vocational and Technical College，Zhoukou 466000，China；2.Key Laboratory for Animal Immunology of the ministry of Agriculture，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；3.Department of Agronomy，Nanyang Vocational College of agriculture，Nanyang 474150，China）

The aim of the study is to generate high sensitivity and high specificity monoclonal antibody against Sparfloxacin and identification of its immunological characteristics.The artificial immunogen SPFX-BSA and coating antigen SPFX-OVA were obtained using the method of DCC by linking carrier proteins bovine serum albumin（BSA）and ovalbumin（OVA）to Sparfloxacin.Then immune BALB/c mouse，The titer and sensitivity of polyclonal antibody was detected by indirect ELISA and blocking ELISA after four times immunization.The high titer and high sensitivity mouse was selected for cell fusing.High sensitivity and high specificity monoclonal antibody was prepared after mang times subcloning，and immunological characterization were characterized.The preparation of ascites was carried out using in vivo induction method.Indirect ELISA showed a high titer above 1.28×104of the antiserum of all the six BALB/cmouse.Four hybridoma cell lines of 4H4-C8、4H4-C4、4H 4-B1 and 4H4-E9were screened after cell fusing，the indirect ELISA titer of the mAb were 1∶1.4×103、1∶8.0×102、1∶5.0×102、1∶6.7×102in supernatant and 1∶2.6×106in ascites.The special mAb showed good sensitivity with IC50of 31μg/L to Sparfloxacin.This test was synthesized successfully SPFX artificial antigens and obtained high sensitivity and specificity monoclonal antibody.It laid a foundation base for the SPFX immunology fast detection methods.

sparfloxacin;artificial antigen;monoclonal antibody;immunological trait

S859.84

A

1001-2230（2015）05-0018-04

2015-11-05

农业部公益性行业（农业）科研专项（201003008-09）。

曹德玉（1968-），男，副教授，主要研究方向为食品安全检测。