Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 和Streptococcus thermophilus接种比例对Bifi

李慧，白梅，王记成，魏爱彬，孔亚楠，张和平，孙天松

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 和Streptococcus thermophilus接种比例对Bifidobacterium lactis益生菌发酵乳品质的影响

李慧，白梅，王记成，魏爱彬，孔亚楠，张和平，孙天松

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）

将Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02（LB-ND02）和Streptococcus thermophilusND03（ST-ND03）按1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000接种于脱脂乳中，同时接入益生菌Bifidobacterium lactisV9（B.lactisV9，接种量为2.0×107g-1），于42℃进行发酵。通过对发酵及贮藏过程中发酵乳指标的测定，评价LB-ND02和ST-ND03的接种比例对发酵乳品质的影响。结果表明，随着LB-ND02接种比例减小，凝乳时间显著延长，B.lactisV9活菌数显著提高。4℃贮藏28 d后，随LB-ND02接种比例减小，B.lactisV9存活率差异显著，后酸化也显著减弱。研究发现，LB-ND02和ST-ND03的接种比例，显著影响发酵乳的发酵时间、B.lactisV9活菌数、后酸化及黏度。

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02；Streptococcus thermophilusND03；Bifidobacterium lactisV9；益生菌发酵乳品质

0 引言

益生菌发酵乳品质受发酵剂、发酵温度、发酵时间、贮藏条件等因素影响[1]。酸度、黏度、持水性、益生菌活菌数等是评价发酵乳品质的重要指标，尤其是益生菌的活菌数，是发挥益生特性的重要保证[2-3]。已发现货架期内一些产品中益生菌的活菌数低于106g-1[4-7]。研究表明，菌株特性、后酸化、发酵剂、溶氧量及贮藏条件等对其活菌数均有影响[8-11]。

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02和Streptococcus thermophilusND03分离自传统发酵乳制品，并完成了基因组全序列测定，二者具有应用于发酵乳中良好的潜质[12-13]。Bifidobacterium lactisV9（B.lactisV9）分离自健康蒙古族儿童粪便，具有良好益生特性的益生菌，已经完成的基因全序列的测定[14-17]。

本研究通过改变保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的接种比例，探讨其对益生菌发酵乳品质的影响。

1 实验

1.1 材料和仪器

Bifidobacterium lactisV9、Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02、Streptococcus thermophilusND03均为直投式发酵剂。脱脂乳粉。

MRS合成培养基，Eppendorf TGL-168高速台式离心机，pH计（雷磁PHS-3C，生化培养箱(LRH-250)，无菌工作台（NSC-ⅡA-1200），全自动高压灭菌器（HIRAYAMA HA-300M），Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度仪。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

将脱脂乳粉于45～50℃软化水中完全溶解，制成质量分数为11%还原乳，95℃5min杀菌，冷却至42℃，按表1的接种量接入LB-ND02和ST-ND03，并以2.0× 107g-1接入B.lactisV9，于42℃恒温发酵至pH值4.5终止发酵，4℃贮藏28 d。

表1 发酵乳中LB-ND02和ST-ND03的接种量（g-1）

1.2.2 发酵乳发酵及贮藏特性

发酵乳在42℃发酵及4℃28 d贮藏过程中，定期取样测定发酵乳样品pH值、滴定酸度（TA）、游离氨基氮（FAN）浓度、黏度、脱水收缩性及活菌数。

1.2.2.1 pH值测定

调整试验样品温度至20℃，采用精密pH计（雷磁PHS-3C）测量。

pH降低率：pH-DR=（pH始-pH终）/发酵时间。

1.2.2.2 滴定酸度测定

滴定酸度按GB5413.34-2010中方法测定[18]。

滴定酸度增加率为TA-IR=（TA终-TA始）/发酵时间。

1.2.2.3 游离氨基氮含量测定

游离氨基氮（FAN）的测定采用邻苯二甲醛衍生比色法，参照Lemieux[19]和Church[20]等人的方法。

游离氨基氮增加率：FAN-IR=（FAN终-FAN始）/发酵时间。

1.2.2.4 黏度测定

调整发酵乳样品温度至20℃，采用Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度仪(Brookfield Engineering Laboratories,Inc,Middleboro,MA)4#转子进行测定，其中转子转速为100 r/min，扭矩为10%～100%，测定时间为30 s。

1.2.2.5 脱水收缩性的测定

称取20.0 g发酵乳样品，置于带有滤纸（双圈牌中速定性滤纸）的漏斗中，4℃放置120 min，收集滤液并称重[21]。

脱水收缩性（%）=（滤液质量/样品质量）×100。

1.2.2.6 活菌数测定

取1.0 g发酵乳样品用灭菌PBS水溶液（质量分数0.8%的NaCl，0.02%的KH2PO4，0.115%的Na2HPO4，0.05%的半胱氨酸）梯度稀释至一定倍数后，分别采用选择培养基平板倾注法测定LB-ND02、ST-ND03和B.lactisV9的活菌数。

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02的选择培养采用文献[22]中的方法，MRS固体培养基，调节pH值为4.58，43℃厌氧培养72 h。

Streptococcus thermophilusND03的选择培养采用文献[23]中的方法，ST固体培养基，37℃需氧培养24 h。

B.lactisV9的选择培养采用国标GB 4789.35-2010中改良MRS固体培养基平板倾注法[24]，37℃厌氧培养72 h。

1.3 数据统计分析

每个指标的测定均做3个平行样，采用SAS软件的ANOVA程序进行方差分析，采用origin7.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 发酵期间及发酵终点不同接种比例对发酵乳品质的影响

LB-ND02与ST-ND03不同接种比例发酵乳在发酵期间pH值降低率（pH-DR）、滴定酸度增加率（TAIR）、游离氨基氮增加率（FAN-IR）及发酵时间、发酵终点酸度（TA终）、发酵终点游离氨基氮（FAN终）、发酵终点活菌数见表2。

随LB-ND02接种比例的逐渐减小，发酵乳pH值降低率、滴定酸度增加率和游离氨基氮增加率显著减小（P＜0.05），发酵至终点（pH值为4.5）所需时间显著延长（P＜0.05），发酵至终点B.lactisV9活菌数显著增大（P＜0.05）。其中LB-ND02与ST-ND03按1∶1000和1∶100接种时，发酵终点发酵乳中B.lactisV9活菌数（对数值）分别为（8.32±0.02）g-1和（8.01±0.04）g-1，较接种时（7.30 g-1，对数值）分别增加10倍和5倍，而按比例为1∶10接种时活菌数基本没有变化。由此可见，降低LBND02的接种量，使发酵乳酸化速率减缓，发酵时间延长，增加了B.lactisV9活菌数。

众所周知，与两者单独培养相比，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合培养后的产酸速度非常快，因为混合培养过程将促进两者维持更好的生长[1]。Pette等人[25]证实保加利亚乳杆菌发酵乳中无菌过滤物可以促进嗜热链球菌的生长。进一步研究得出，刺激嗜热链球菌生长的这种过滤物中富含氨基酸。而嗜热链球菌生长产生的嘌呤、嘧啶、CO2、甲酸、草酰乙酸、富马酸等可刺激保加利亚乳杆菌生长[1]。因此，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例会影响二者在发酵乳中的共生关系，从而影响产酸速率和发酵时间。本研究中，改变LB-ND02与ST-ND03的接种比例，显著影响了发酵时间。这是由于降低LB-ND02的接种量时，其水解蛋白产生的游离氨基酸浓度减少，使与ST-ND03的共生能力趋于减缓，产酸较慢，发酵时间延长。

表2 发酵乳在发酵期间和发酵终点（pH4.5）酸度、FAN、发酵时间及活菌数结果(n=3,x±SD)

已有研究表明，双歧杆菌因缺少蛋白质水解活性，在乳中的生长受到一定限制，增加蛋白质水解物或与蛋白质水解能力强的菌株混合发酵，其活菌数可以得到有效的提高[26]。本研究中，LB-ND02与ST-ND03按1∶1接种时，发酵结束B.lactisV9活菌数（7.15 g-1，对数值）较接种时（7.30 g-1，对数值）略有降低。虽然此接种比例下较高的游离氨基氮可供B.lactisV9利用，但由于发酵时间（330 min）较短，B.lactisV9的生长受到限制；另一原因可能为LB-ND02产生的过氧化氢抑制了B.lactisV9的生长。Gilliland和Speck研究表明，保加利亚乳杆菌生长过程中会产生过氧化氢，过氧化氢会抑制双歧杆菌糖代谢的关键酶—果糖-6-磷酸-磷酸酮酶（F6ppk），从而引起氧中毒[9]。从表2可知，当LBND02与ST-ND03按1∶1000和1∶100接种时，发酵结束B. lactisV9的活菌数较高，这是由于此比例下，较少的LBND02接种量，对B.lactisV9的影响较小，且蛋白水解能力有限，使发酵乳中游离氨基氮浓度较低，延长了发酵时间，B.lactisV9得到了较好的生长。

2.2 贮藏期间不同接种比例对发酵乳品质的影响

LB-ND02与ST-ND03不同接种比例发酵乳在4℃贮藏28 d后pH值降低量、滴定酸度增加量如表3所示。由表3可以看出，随LB-ND02接种比例减小，贮藏28 d后发酵乳pH值降低量和TA增加量显著减小（P＜0.05）。可见，减少LB-ND02的接种量，可减缓发酵乳的后酸化现象。后酸化现象对发酵乳的品质影响巨大，最直接的后果是导致发酵乳无法长期贮存，影响其正常消费。保加利亚乳杆菌细胞壁或细胞膜对乳糖酶活性有一定的保护作用，因此造成发酵乳在贮藏过程中乳糖继续被利用，导致了后酸化现象发生[27]。本研究中，LB-ND02与ST-ND03接种比例为1∶1和1∶10发酵乳后酸化较强，不仅与其中LB-ND02接种量大有关，还与其发酵结束游离氨基氮浓度高有关，因为较高的游离氨基氮浓度会刺激ST-ND03的进一步生长代谢，促进酸的生成。LB-ND02与ST-ND03接种比例为1∶1000和1∶100发酵乳后酸化现象较轻，可满足实际生产需求。

LB-ND02与ST-ND03不同接种比例发酵乳在4℃贮藏28 d期间黏度和脱水收缩性变化如图1和图2所示。发酵乳黏度呈波动下降趋势，其中，LB-ND02和ST-ND03接种比例为1∶1时，发酵乳黏度显著低于其他组（P＜0.05）。发酵乳的脱水收缩性均有轻微上升，但无显著性的差异（P＞0.05）。可见，除LB-ND02与ST-ND03接种比例为1∶1外，其他接种比例不影响发酵乳的黏度；所有接种比例并不影响发酵乳脱水收缩性。发酵过程中发酵剂产生的胞外多糖类黏性物质，有助于改善发酵乳的组织状态和黏稠度，特别是在发酵乳干物质含量不太高时尤为重要[1]。本研究中，LBND02与ST-ND03按1∶1比例接种，发酵乳黏度低于其他比例组，这是由于ST-ND03的接种量（1.1×106g-1）较其他比例组（2.2×106g-1）低的缘故。秦南冰等也得到类似的结果，他们发现增加嗜热链球菌接种量可增加发酵乳黏度[28]。脱水收缩性是发酵乳凝胶对各种乳成分尤其是水分的结合能力，这种结合能力包括对结合水和凝胶立体网络中自由水的结合能力，脱水收缩性越小说明凝胶在规定的时间内失去的乳清越少[1]。脱水收缩性与发酵剂接种量有关，较大的接种量会使发酵乳产酸加快，蛋白水合能力减弱，导致贮藏过程中乳清析出[1]。本研究中所有比例组发酵乳脱水收缩性没有差异，这是由于各比例组LB-ND02与STND03的初始接种量相同，发酵结束各比例组中LBND02与ST-ND03的活菌总数（见表2）基本相同。

LB-ND02与ST-ND03不同接种比例发酵乳在4℃贮藏28 d后LB-ND02、ST-ND03和B.lactisV9存活率如表3所示。LB-ND02与ST-ND03接种比例为1∶100发酵乳中，LB-ND02和ST-ND03的存活率（41.69%±0.14%和77.62%±0.20%）显著高于其他比例组（P＜0.05）。LB-ND02与ST-ND03接种比例为1∶1发酵乳中B.lactisV9的存活率（23.44%±0.23%）显著低于其他组（分别为91.20%±0.46%，85.11%±0.52%，79.43% ±0.33%）（P＜0.05）。发酵乳中乳酸菌的活菌数在货架期内必须保持一定数量，本研究中LB-ND02与STND03接种比例为1∶100发酵乳中，LB-ND02和STND03的存活率最高，有应用于实际生产中良好潜力。本研究中LB-ND02与ST-ND03接种比例为1∶1发酵乳中B.lactisV9的存活率很低，这是由于发酵时间较短，B.lactisV9没有得到充分生长，加上后酸化影响，故其存活率最低。而其他接种比例组中B.lactisV9的存活率并没有随其后酸化减弱而增高，可见后酸化并不是造成B.lactisV9死亡的主要原因。如前所述，可能是发酵乳中过氧化氢累积造成B.lactisV9的死亡，但是本研究中没有对发酵乳中过氧化氢质量分数进行测定，是否由此导致B.lactisV9活菌数下降，有待进一步研究。虽然LB-ND02与ST-ND03接种比例为1∶10发酵乳中B.lactisV9存活率最高，但由于发酵时间较短，发酵结束活菌数较低（见表2），实际生产中受到局限。LB-ND02与ST-ND03接种比例为1∶1000和1∶100发酵乳中B.lactisV9存活率在80%左右，且发酵结束其活菌数增加5-10倍（见表2），综合发酵所用时间考虑，LB-ND02与ST-ND03接种比例为1∶100时，更适于实际生产应用。

4 结论

本研究通过对发酵乳的酸度、黏度、脱水收缩性、FAN及活菌数的测定，评价LB-ND02和ST-ND03的接种比例对B.lactisV9益生菌发酵乳品质的影响。研究发现，LB-ND02和ST-ND03的接种比例，显著影响发酵乳的发酵时间、B.lactisV9活菌数、后酸化及黏度。当降低LB-ND02接种量时，可提高B.lactisV9的活菌数，减轻发酵乳后酸化现象。综合结果分析，当LBND02与ST-ND03接种比例为1∶100时，发酵乳发酵时间适宜、发酵结束B.lactisV9活菌数较高，贮藏期间后酸化较轻、B.lactisV9存活率较高，可应用于实际生产。

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Effects of inoculum ratios of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and Streptococcus thermophilus on the quality of probiotic fermented milk by Bifidobacterium lactis

LI Hui,BAI Mei,WANG Ji-cheng,WEI Ai-bin,KONG Ya-nan,ZHANG He-ping,SUN Tian-song
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineer,Education Ministry of China,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China)

Different ratios(1∶1,1∶10,1∶100,1∶1000)ofLactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02(LB-ND02)andStreptococcus thermophilusND03(ST-ND03)plus withBifidobacterium lactisV9(B.lactisV9,2.0×107g-1)were used as starter cultures for milk fermentation.Some indexs of prepared probiotic fermented milk were determined for evaluation for effect of different ratios of inoculum on the quality of probiotic fermented milk during the fermentation and storage.The results showed the fermentation time was significantly prolonged,viable numbers ofB. lactisV9 was significantly increased.After the fermentation followed by a 28 d storage,the survival ofB.lactisV9 were significantly different and the postacidifition was weakened as the ratio of LB-ND02 decreased..It is suggested that different ratios of LB-ND02 and ST-ND03 significantly influence the fermentation time,viable numbers ofB.lactisV9,postacidifition and visicosity during the fermentation and storage.

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricusND02;Streptococcus thermophilusND03;Bifidobacterium lactisV9;Quality of probiotic fermented milk

TS252.54，Q93-33

A

1001-2230（2012）03-0007-04

2011-11-07

国家高技术研究发展计划（NO.2011AA100901，2011AA100902）；现代农业产业技术体系建设项目资助（No.nycytx-0501）；内蒙古自治区自然科学基金（2010Zd17）。

李慧(1987-)，女，硕士研究生，从事乳制品科学方面的研究。

孙天松