乙酸钠和丁酸钠对奶牛乳腺脂肪酸合成相关基因的影响

孔庆洋，林叶，李庆章

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

乙酸钠和丁酸钠对奶牛乳腺脂肪酸合成相关基因的影响

孔庆洋，林叶，李庆章

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

采用荧光定量RT-PCR方法，探讨了外源添加乙酸钠和丁酸钠，对乳腺上皮细胞中乳脂肪酸合成的关键酶基因的影响，并采用半自动生化分析仪检测了添加乙酸钠和丁酸钠后培养体系中三酰基甘油浓度的变化，确定了体外调控乳脂肪酸生物合成的最佳乙酸钠浓度为16 mmol/L，最佳丁酸钠浓度为0.75 mmol/L，为人工调控乳成分的合成提供了理论依据。

乙酸钠；丁酸钠；乳脂肪酸合成；FAS；ACC

0 引言

乳腺脂代谢的重要调节发生在mRNA水平，其中乙酰辅酶a羧化酶（ACC）是脂肪酸内源合成途径的限速酶，脂肪酸合酶（FAS）是一种多功能复合酶，对控制动物体脂沉积具有重要的意义。目前，很多研究都集中在添加日粮或用动静脉物质浓度差和血流量的方法,来调控乳脂的合成[2],但国内外在mRNA水平上研究添加乙酸和丁酸对乳脂合成的影响尚未见报道。本实验研究乙酸钠和丁酸钠对奶牛乳腺上皮细胞两种脂肪酸合成关键酶ACC和FAS在mRNA水平的影响和对乳脂合成能力的作用，旨在筛选出调控乳脂肪生物合成的最佳前体物浓度，为进一步提高乳质量和乳产量提供理论依据。

1 实验

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及鉴定

取泌乳期乳腺组织块，置于含有培养液的小瓶中，在超净台上分离修剪，洗净血凝块，尽量剥离实体组织和结缔组织，将呈白色颗粒状的腺泡组织尽量剪碎，置于I型胶原酶中，37℃消化3.5～4 h，400目筛网过滤，D-Hank’s液清洗滤出液直至上清液无混浊物，将细胞沉淀以适量的密度接种于培养瓶中，于CO2培养箱中培养[3]。乳腺细胞从组织块周围生长，单层细胞融合至培养瓶底壁90%左右，吸出原有培养液，根据上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶消化敏感性不同纯化乳腺上皮细胞[4,5]。应用免疫荧光细胞染色法检测纯化后乳腺上皮细胞中角蛋白18的表达情况，激光共聚焦显微镜观察。

1.2.2 乙酸钠和丁酸钠的添加

待稳定培养24 h的细胞融合度达到70%～80%时开始在细胞培养液中添加不同浓度的乙酸钠和丁酸钠，乙酸钠浓度设定为：0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0mmol/L，每组3个平行；丁酸钠浓度设定为0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25mmol/L，每组3个平行[6]。培养24h后收集乳腺上皮细胞和培养液，分别进行荧光定量RT-PCR检测和甘油三酯浓度测定。

1.2.3 mRNA水平表达的检测

采用TRlzol试剂提取乳腺上皮细胞中总RNA，使用甲醛变性凝胶电泳的方法检测RNA可用，使用Primer5.0进行PT-PCR法检测所需要的引物设计（表1）。RNA经过反转录后使用TaKaTa公司的SYBRPrime-ScriptTMEx TagTM试剂盒进行荧光定量PCR实验，溶解曲线分析，每个基因进行3个平行实验。实验数据以软件导出，采用2-△△ct相对定量方法进行计算。

表1 引物序列

1.2.4 胞外三酰基甘油的测定

按照说明书配制反应溶液，以546 nm为主波长测定吸光度，根据公式：三油甘脂浓度=（A样品÷A校准）×标准浓度，计算三酰基甘油浓度。

1.2.5 数据处理与统计分析

实验所得数据采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，数据表示为平均值（X）±标准误（SE）。

2 结果

2.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定

本研究选取泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织，通过组织块培养法进行乳腺上皮细胞的原代培养，每2 d换1次培养液，培养至10 d左右乳腺组织块周围出现乳腺上皮细胞（图1）。

应用免疫荧光方法检测纯化后的乳腺上皮细胞中角蛋白18的表达，激光共聚焦显微镜观察。结果显示：乳腺上皮细胞中角蛋白18的表达呈阳性（图2）。绿色荧光为表达于细胞质中的角蛋白18，红色为PI染色的细胞核。

2.2 添加乙酸钠对基因表达及TG合成的影响

采用荧光定量RT-PCR方法检测乳腺上皮细胞中羧化酶（ACC）和FAS mRNA的表达，采用半自动生化分析仪检测培养体系中TG浓度的变化，结果如表2所示。与未添加丁酸钠的乳腺上皮细胞相比，当乙酸钠浓度为16 mmol/L时，乳腺上皮细胞内脂肪酸合酶（FAS）基因表达量增加437%，ACC基因表达量增加727%，乳腺上皮细胞分泌的TG增加30%（P＜0.05）。

2.3 添加丁酸钠对基因表达以及TG合成的影响

表3为不同浓度丁酸钠对奶牛乳腺上皮细胞FAS、ACCmRNA表达及TG合成的影响。由表3可以看出，与未添加丁酸钠的乳腺上皮细胞相比，当丁酸钠浓度为0.75 mmol/L时，FAS基因表达量增加432%，ACC基因表达量增加720%，乳腺上皮细胞胞外分泌的TG增加27%（P＜0.05）。

表2 不同浓度乙酸钠对奶牛乳腺上皮细胞FAS、ACCmRNA表达及TG合成的影响

表3 不同浓度丁酸钠对基因表达及TG合成的影响

3 讨论

在乳腺中，乳脂的合成发生在乳腺上皮细胞滑面内质网的表面。乳脂合成中所需的C4～C10脂肪酸100%由乳腺上皮细胞从头合成，因此脂肪酸从头合成的原料乙酸和丁酸对泌乳期奶牛的乳脂合成尤为重要。乙酸和丁酸是由瘤胃合成后进入血液的主要挥发性脂肪酸，经乳腺吸收后被乳腺上皮细胞用来重新合成短链脂肪酸，进而用于合成乳脂肪三酰基甘油[10-11]。乳腺上皮细胞脂肪酸的合成主要由2种酶催化，ACC和FAS。本实验结果显示，添加乙酸钠和丁酸钠后，乳腺上皮细胞中ACC和FAS的表达显著增加，在高峰期大约是未添加细胞的5～8倍。ACC是动物体中调节脂肪酸合成的限速酶，与脂肪酸的从头合成密切相关,其活性在多个水平被调节。它的基因在两个不同品系奶牛的泌乳期乳腺中表达不同[10]，表明这个基因在泌乳期脂肪酸合成中直接发挥作用。FAS它催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链FA。它由两条相同的多肽组成，每条多肽有2500个氨基酸残基和7个活性位点，具有功能活性的FAS以从头到尾的昂表现为二聚体形式。FAS基因的表达直接影响着脂肪酸合成酶的多寡，对控制动物体脂沉积有重要意义。乙酸钠和丁酸钠能够增加两种基因的表达，促进组成乳脂重要的甘油三酯分别增加，进而增强乳腺上皮细胞的泌乳能力。

本研究在乳腺上皮细胞中分别添加不同浓度的乙酸钠和丁酸钠，并通过RT-PCR方法检测了乳脂肪酸合成关键基因ACC和FAS mRNA水平的表达变化，确定体外培养体系中调控乳脂肪酸合成的最佳乙酸钠浓度为16 mmol/L，最佳丁酸钠浓度为0.75 mmol/L，此时乳腺上皮细胞三酰基甘油的合成量最高。

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Influence on cow breast fatty acid biosynthesis related genes with sodium acetate and sodium butyrate

KONG Qing-yang，LIN Ye，LI Qing-zhang
(Northest Agricultural University,Harbin 150030,China)

Using fluorescence quantitative RT-PCR method,explored the effects of exogenous additives sodium acetate and sodium butyrate on gene expression of the key enzymes in milk fatty acid synthesis in mammary epithelial cells of dairy cow.And using semi-automatic biochemical analyzer detected the triacylglycerol concentration after adding sodium acetate and sodium butyrate in culture system,determined that the optimal sodium acetate was 16 mmol/L and sodium butyrate was 0.75 mmol/L regulating the biosynthesis of milk fat in vitro,provided a theoretical basis for artificial regulation of milk components.

sodium acetate;sodium butyrate;milk fatty acid synthesis；FAS；ACC

TS252.1

A

1001-2230（2012）03-0015-03

2011-10-18

国家高技术研究和发展863计划（2006AA10Z1A4），东北农业大学创新团队计划（CXT005-1-1/2）。

孔庆洋（1986-）女，硕士，从事泌乳生物学与乳腺功能调控研究。

李庆章