酶解酪蛋白制备易于消化吸收肽的工艺研究

王彩云，荆莹，石丹，云战友

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，呼和浩特 010080)

酶解酪蛋白制备易于消化吸收肽的工艺研究

王彩云，荆莹，石丹，云战友

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，呼和浩特 010080)

为了提高酪蛋白的消化吸收利用率，利用胰蛋白酶对酪蛋白进行水解改性，制备易消化吸收的肽。通过对水解工艺的研究，得到了胰蛋白酶水解酪蛋白的优化工艺条件：E/S为14 000 U/100 mL，温度为50℃，pH值为8，水解时间为2.5 h，底物质量分数为8%。利用此工艺得到的酪蛋白水解物的水解度为7.6%，水解物中分子量在2 000～180 u的肽质量分数占80%，其中1 000～180 u的水解物占总水解物的59%。

胰蛋白酶；酪蛋白；水解度；分子量分布

0 引言

酪蛋白是牛乳蛋白的一种主要成分，在牛奶中与乳清蛋白的质量分数之比接近80∶20[1]。当酪蛋白进入胃内与胃液混合后形成较大凝块且坚硬，不易被消化吸收。已有研究表明酪蛋白经酶水解后生成低分子量的小肽，有利于人体对酪蛋白的消化吸收。这是由于蛋白质完全水解后，在相同浓度下，相同氨基酸组成的肽比游离氨基酸吸收速度快[2，3]。动物所能吸收的肽主要是由10个以下氨基酸残基构成的寡肽（1 000～180 u）,尤其是小肽(二肽、三肽)[4]。因此，从消化吸收的角度考虑，理想的酶解产物以寡肽质量分数较多为宜。

本研究采用胰蛋白酶对酪蛋白进行水解，以获得寡肽质量分数较高、而游离氨基酸质量分数相对较少的酪蛋白水解产物。

1 实验

1.1 材料

胰蛋白酶(Trypsin)，酪蛋白（Casein），其他试剂均为优级纯或分析纯。

1.2 仪器

紫外-可见分光光度仪（756PC型）；电子天平（BP211D型）；自动电位滴定仪（785MP型）；冷冻水浴恒温振荡器（LSHZ-300型）；凯氏定氮仪（B324型）；微电脑变频电磁炉（C-01型）。

2 方法

2.1 水解工艺

8%的酪蛋白溶液→用氢氧化钠将pH值调至适宜值→将样品置于振荡水浴锅里，待样品温度升至酶解温度时加酶，混匀，水解，摇床转速为80 r/min→定时取样→沸水浴灭酶活10 min→检测

2.2 检验方法

酶活力的测定采用紫外分光光度法测定蛋白酶的活力[5]；水解度（DH）的测定采用三硝基苯磺酸法(Trinitrobenzene sulfonicacid，TNBS)[6-7]；肽分子量分布测定[8]采用高效液相色谱方法测水解产物的分子量分布。

2.3 实验设计[9]

2.3.1 最适酶解时间

将酪蛋白溶液的pH值固定至8.00，固定酶和底物浓度比为10 000 U/100 mL，固定酶解温度为55℃，分别在不同酶解时间条件下对酪蛋白进行水解，灭酶活，测定水解度、分子量分布，以分子量分布为指标确定最适酶解时间。

2.3.2 最适pH值

酶解时间采用2.3.1中方法，确定的最适酶解时间，固定酶和底物浓度比为10 000 U/100 mL，，固定酶解温度为55℃，分别在适当的不同pH值下对酪蛋白进行水解，灭酶活，测定水解度、分子量分布，以分子量分布为指标确定最适pH值。

2.3.3 最适酶解温度

采用2.3.1和2.3.2中所确定的最适酶解时间和最适pH值，固定酶和底物浓度比，分别在适当的不同温度下对酪蛋白进行水解，灭酶活，测定水解度、分子量分布，以分子量分布为指标确定最适酶解温度。

2.3.4 最适酶和底物浓度比

采用2.3.1，2.3.2和2.3.3中所确定的最适酶解时间、最适pH值和最适酶解温度，分别在不同酶和底物浓度比条件下对酪蛋白进行水解，灭酶活，测定水解度、分子量分布，以分子量分布为指标确定最适酶和底物浓度比。

2.3.5 酶解最优工艺条件的确定

以分子量分布为考察指标。对水解条件进行优化。确定酶解的最佳工艺。对水解温度、pH值、酶与底物浓度比（E/S）、反应时间进行四因素三水平正交实验。分子量分布为2次重复实验的平均值。因素和水平排列如表1所示。

表1 正交实验

3 结果与分析

3.1 原料测定

3.1.1 胰蛋白酶活性的测定

以酪氨酸溶液质量浓度为横坐标，相对应的275 nm下的吸光值为纵坐标，绘制线性回归曲线，得回归方程为A=0.0074C+0.0093，R2=0.9998。如图1所示。

通过酪氨酸标准曲线方程计算出胰蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活力为23 027 U/g。

3.1.2 酪蛋白指标分析

对原料酪蛋白各项成分检测结果如表2所示。

表2 酪蛋白成分检测结果%

3.2 最适酶解时间

图2为酶解时间对分子量分布和水解度的影响。由图2可以看出，在酶解过程中，随着酶解时间的延长，酶解液水解度逐渐升高，在酶解进行到120 min时达到最高，之后随着酶解时间的延长，水解度略有降低并趋于平缓。从分子量分布来看，在酶解过程中，随着酶解时间的延长，酶解液中大分子量的产物逐渐减少，但是在240 min的水解过程中，各个时间段内分子量在1 000～180 u的酶解产物分布相对稳定，均在27%～29%之间。因此综合考虑分子量分布及水解度等因素拟定最适酶解时间为120 min。

3.3 最适pH值

图3为pH值对分子量分布和水解度的影响。由图3可以看出，当初始pH值为8.00时，酶解产物的水解度达到最大值；酶解初始pH值为8.00时，酶解产物的分子量在1 000～180 u的质量分数较多，而小于180 u的游离氨基酸质量分数最低。因此，拟定的酶解初始pH值为8.00。

3.4 最适酶解温度

众所周知，在蛋白酶酶解过程中有一个最适的反应温度，在一定范围内升高温度，底物转变成产物的速度加快，酶解效率也相应提高，表现在水解度上则呈增加趋势。但是如果温度过高，或者过低都不利于酶解反应的进行。由图4可以看出，酶解温度在50℃到55℃时，酶解产物水解度保持一个较高的水平，而当酶解温度超过55℃，酶解产物水解度开始下降。从分子量分布来看，酶解温度为52.5℃时，酶解产物的分子量在2 000～180 u质量分数最多，大于10 000 u和小于180 u的水解物质量分数较少。因此，拟定的酶解温度是52.5℃。

3.5 最适酶和底物浓度比

图5为酶与底物的比对分子量分布和水解度的影响。由图5可以看出，在E/S=12 000时，酶解产物的水解度最大。由分子量分布可知在E/S=12000时，酶解产物在分子量段为2 000～180 u的质量分数最高，大于10 000 u的质量分数偏低，小于180 u的居中。因此，单因素实验结果酶与底物浓度比确定为12 000 U/ 100 mL。综合以上实验结果，单因素确定的水解条件：时间为2 h，pH值为8.00，温度为52.5℃，E/S=12 000。

3.6 酶解最优工艺条件的确定

通过单因素试验，得到各因素的最佳值，从而确定每个因素的最佳使用区域，并通过正交实验，进一步优化实验结果。正交实验设计如表3所示；极差分析结果如图6所示。

根据极差R的大小来确定各因子影响指标的主次顺序，由表4结合极差分析图6可以看到各因子的极差R的大小依次为C＞B＞D＞A，因此各因素的影响排列顺序依次为温度＞pH值＞E/S＞时间。

由于方案设计以分子量分布在1000～180u的水解物为目标，因此，得到工艺的最优方案为A3B2C1D3，对应的水解条件为：时间2.5 h、pH值8、温度50℃、E/S为14 000，即正交实验中8号方案。该条件下对应的水解度为7.6%。

表3 L9(34)正交实验结果

4 结论

通过单因素和正交实验，以水解物分子量在180～1 000 u的小肽质量分数作为指标，确定了胰蛋白酶水解酪蛋白的最优工艺：水解温度为50℃，E/S为14 000， pH值为8，水解时间为2.5 h。此时，胰蛋白酶水解酪蛋白的水解度为7.6%，酶解产物主要是分子量在180～2 000 u的多肽，占到总水解物的80%，而分子量180～1 000 u的寡肽占到59%，游离氨基酸质量分数较少，适合人体的消化吸收。该酪蛋白水解工艺的建立，为酪蛋白水解肽的应用开发进一步奠定了基础。

[1]LARA-VILLOSLADA F.The Balance Between Caseins and Whey Proteins in Cow’s Milk Determines its Allergnicity.[J]J.Dairy Sci, 2005，88：1654-1660

[2]SIEMENSMA A D.The Importance of Peptide Lengths in Hypoallergenic Infant Formulae[J].Trends Food Sci.&Tech.，1993，4：16-21.

[3]WEBB K E.The Developments in Gastrointestinal Absorption Tissue Utilization of Peptides[J].Dairy Science,1993，76（1）：351-361.

[4]李成会.蛋白质营养的新阶段:肽营养[J].畜禽业，2005（11）：:48-50.

[5]王晓杰,郑喜群,刘晓兰,等.复合酶复合水解对玉米蛋白酶解效率的影响[J].中国酿造,2010,12:99-103.

[6]荆莹.酪蛋白的酶水解改性研究[D].内蒙古农业大学,2010.

[7]ADLER-NISSEN.Determination of The Degree of Hydrolysis of Food Protein Hydrolysates by Trinitrobenzenesulfonic acid[J].Agric Food Chem 27:1256–1262.

[8]QB/T 2653-2004,大豆肽粉[S].北京：中国轻工业出版社,2004.

[9]王钦德.食品试验设计与统计分析.[M]北京：中国农业大学出版社，2003.

Study on the technology for hydrolysis of casein for digestion and absorption of peptides

WANG Cai-yun,JING Ying,SHI Dan,YUN Zhan-you
(Inner Mongolia Yili Industrial Group.,Co Ltd,Technoligy Center,Hohhot 010080,China)

In order to improve digestion and absorption of casein,casein hydrolysate was prepared by trypsin,it is easy to digest and absorb. The conditions of hydrolized casein by the trypsin were studied and found that optimize the parameters were as follows:enzyme to substrate ratio(E/S)14 000 U/100 mL,temperature 50℃,pH in the beginning 8,hydrolysis time 2.5 h,mass fraction of substrate 8%.Under the optimum conditions of the trypsin hydroyzate of casein,degree of hydrolysis was 7.6%,mass fraction of molecular weight 2 000～180 was 80%, mass fraction of molecular weight 1 000～180 was 59%.

trypsin；casein；degree of hydrolysis；molecular weight distribution

Q936

A

1001-2230（2012）03-0018-04

2011-10-17

国家十一五科技支撑计划资助项目(2006BAD04A06)。

王彩云（1979-），女，硕士研究生，从事乳品工艺研发工作。