枸杞对乳酸杆菌体外保存活力及体内定植的影响

王瑞君

(宜春学院化学与生物工程学院,江西宜春 336000）

枸杞对乳酸杆菌体外保存活力及体内定植的影响

王瑞君

(宜春学院化学与生物工程学院,江西宜春 336000）

研究了枸杞对乳酸杆菌保存和体内定植的影响。采用MRS液体培养基中添加不同浓度的枸杞水解产物，观察一个月内常温下培养基中乳酸杆菌活菌数的变化。实验小鼠用抗生素脱污染，导致菌群失调后，分别用单一乳酸杆菌治疗、乳酸杆菌与枸杞联合治疗5 d后，统计不同治疗组中指示菌的变化，确定枸杞对乳酸杆菌在体内定植的影响。结果表明，添加不同体积分数的枸杞水解产物后，MRS液体培养基中乳酸杆菌的存活数高于对照组；实验小鼠用不同方式治疗后，联合治疗组乳酸杆菌的数量高于单一乳酸杆菌治疗组。枸杞对乳酸杆菌的保存及体内定植具有促进作用。

枸杞；乳酸杆菌；保存活力；定植

0 引言

研究表明乳酸菌等益生菌有助于降低宿主体内胆固醇水平[1]、改善宿主的免疫功能[2]。许多研究证实益生菌对腹泻、过敏、肠易激综合征、炎症性肠病等有疗效[3,4]。但益生菌通过胃肠道定植时易受胃酸、胆汁等因素的影响而使其活菌数急剧下降，不利于益生菌发挥益生作用。益生菌产品在存放、运输等过程中易受温度等环境条件的影响而使活菌数不稳定。本文研究枸杞对乳酸杆菌的保存定植是否有促进作用，以期克服益生菌在应用时存在的问题。

枸杞（Lycium chinenseMill.）富含枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜素、抗坏血酸、莨菪亭、氨基酸及矿质元素等多种成分[5-6]，具有抗氧化、提高免疫力等多种功效[7-9]。对于枸杞的化学成分、药理、保健功能等研究较多，但有关枸杞等中草药对益生菌的保存、定植等促进作用研究未见报道。通过本文的研究可为微生态制剂的研发提供一定的理论依据。

1 实验

1.1 材料

枸杞，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus）。

培养基：MRS培养基用于乳酸杆菌的活化、培养、计数。EMB培养基用于大肠杆菌的培养与计数。

氨苄青霉素（用无菌水配制质量浓度为0.5 g/L的氨苄青霉素溶液）。KM小鼠15只，体质量（18±2）g，饲养于洁净动物房内。

1.2 方法

（1）枸杞水解产物的制备。枸杞粉碎，称取50 g，加水500 mL浸泡30 min后煎煮，沸腾后文火煮30 min，过滤，收集滤液，滤渣用同样的方法煎煮2次，过滤，收集滤液。3次滤液混合后，浓缩至生药质量浓度为1 g/mL，3 000 r/min离心10 min，取上清，115℃高压灭菌30 min后置4℃冰箱保存备用。

（2）枸杞水解产物对乳酸杆菌保存活力的影响。将活化的嗜酸乳杆菌以1%的接种量分别接种于含枸杞水解产物0%，2.5%，5%，10%，20%（体积分数）的MRS液体培养基中。37℃，厌氧培养48 h,取样1 mL用MRS固体培养基计数（此时的活菌数定义为0 d的活菌数）。剩余培养液放置室温下，每隔10 d取1 mL培养液用MRS固体培养基计数。比较30 d内乳酸杆菌的存活数。

（3）小鼠脱污染模型的制备。小鼠静养2 d后，无菌条件下，取其粪便称重，用生理盐水稀释后，检测大肠杆菌与乳酸杆菌。小鼠静养2 d后，自由饮用质量浓度为0.5 g/L的氨苄青霉素溶液，连续饮用5 d后，取小鼠粪便检测大肠杆菌与乳酸杆菌。

（4）实验小鼠的分组与处理：小鼠脱污染模型制备成功后，15只小鼠随机分为3组，5只为自然恢复组，每天自由饮用无菌水与自由取食鼠粮。5只为乳酸菌治疗组，小鼠在自由饮用无菌水与自由取食鼠粮的基础上，每天灌胃菌数为108mL-1的乳酸杆菌0.5 mL，每天1次，连续灌胃5 d。5只为枸杞与乳酸杆菌共同治疗组，在每只小鼠每天灌胃乳酸杆菌的基础上在小鼠的食物中添加枸杞子，添加量为10 g/(d·只)，连续5 d。5 d后分别取三组小鼠的粪便检测大肠杆菌与乳酸杆菌的数量。

（5）小鼠体内实验的检测指标。检测大肠杆菌、乳酸杆菌的变化。无菌取小鼠粪便，称重，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选择合适浓度在相应的选择培养基上培养计数。

1.9数据分析：细菌的菌落数转换为对数值。采用spss15.0软件进行统计学分析，组间比较采用student-t检验，差异显著性水平设为P=0.05。

2 结果

2.1 枸杞对乳酸杆菌保存活力的影响

图1为枸杞对乳酸杆菌保存活力的影响。由如图1可以看出，37℃,厌氧条件下培养2 d,空白对照组为5.8×107mL-1，但随着MRS培养基中添加枸杞水解产物浓度的增加，在同样培养时间内，乳酸杆菌的数量呈上升趋势。这一结果表明，在一定浓度范围内，枸杞水解产物对乳酸杆菌的生长有促进作用。

图1数据显示，枸杞水解产物在一定浓度范围内，对乳酸杆菌的保存活力具有促进作用：室温下放置10，20，30 d后，空白对照组乳酸杆菌的存活率（第N天的菌落数/第0天的菌落数×100%）较低，活菌数下降较快，而随着培养基中枸杞水解产物浓度的增加，乳杆菌的存活率显著高于对照组，乳酸杆菌的活菌数下降速度减慢。

2.2 枸杞对乳酸杆菌体内定植的影响

结果如表1所示。抗生素处理5 d后，乳酸杆菌、大肠杆菌的数量与正常组相比，具有极显著差异（P﹤0.01）,小鼠自然恢复5 d后,体内大肠杆菌、乳酸杆菌仍未恢复到正常水平（P﹤0.05）。灌胃乳酸杆菌5 d后，乳酸杆菌恢复到正常水平，但大肠杆菌的数量高于正常组（P﹤0.05）。乳酸杆菌与枸杞联合治疗5 d后，乳酸杆菌与大肠杆菌恢复到正常水平。在两种处理方式中，乳酸杆菌组中乳酸杆菌的数量低于联合治疗组（P﹤0.05），大肠杆菌的数量高于联合治疗组。这一结果表明，枸杞有利于乳酸杆菌在体内的定植以及肠道菌群恢复正常。

表1 枸杞对乳酸杆菌体内定植的影响

3 讨论

图1结果表明，枸杞对乳酸杆菌的生长、保存有促进作用。这一结果的出现可能与枸杞含有多种化学成分有关。枸杞中含有丰富的枸杞多糖，资料证实，乳酸杆菌可发酵利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等多种成分[10]。枸杞多糖可能在乳酸杆菌产生的某些胞外水解酶的作用下分解为阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等多种单糖,为乳酸杆菌的生长、繁殖提供能量。乳酸杆菌为厌氧或微需氧微生物，枸杞中的甜菜碱、绿原酸、抗坏血酸等具有抗氧化作用[11]，可能为乳酸杆菌的存活、定植提供了有利环境。Bae[12]等曾报道枸杞的醇提取物提高了酸奶的抗氧化活性。

嗜酸乳杆菌是人体和其他动物的益生菌，在酸乳等制品中应用广泛，可在动物体内定植。表1数据显示，灌胃嗜酸乳杆菌后提高了体内乳酸杆菌的数目，但大肠杆菌高于正常水平。同时服用枸杞与乳酸杆菌后，枸杞对乳酸杆菌的定植与恢复具有促进作用，且大肠杆菌恢复到正常水平。这一结果表明枸杞对胃肠道微生态平衡具有调节作用。枸杞中营养成分丰富,可能含有促进乳酸杆菌、双歧杆菌等有益微生物生长的生长因子等，促进其生长，使其成为肠道中的优势菌群，增强对大肠杆菌等条件致病菌的拮抗作用。但枸杞成分复杂，各成分对乳酸杆菌的作用机制尚待进一步探讨。

[1]CHEN Y L,WU L Y,LEE T C,et al.Cholesterol-lowering Effect of Phytosterol-containing Lactic-fermented Milk Owder in Hamsters[J]. Food Chemistry,2010,119:1121-1126.

[2]WU R,WANG L,WANG J,et al.Isolation and Preliminary Probiotic Selection ofLactobacilli from Koumiss in Inner Mongolia[J]. Journal of Basic Microbiology,2009,49(3):1-9.

[3]GILLILAND S E.Health and Nutritional Benefits from Lactic Acid Bacteria[J].FEMS Microbiol Rev.,1990,7:175-188.

[4]RASTALL R A,GIBSON G R,GILL H S,et al.Modulation of the Microbial Ecology of the Human Colon by Probiotics,Prebiotics and Symbiotic to Enhance Human Health:an Overview of Enabling Science and Potential Applications[J].FEMS Microbiol.Ecol.,2005,52: 145-152.

[5]谢忱,徐丽珍,李宪铭,等.枸杞子化学成分的研究[J].中国中药杂志, 2001,26(5):323-324.

[6]刘萍,王风英.不同产地枸杞子微量元素的对应分析[J].安徽农业科学,2008,36(19):8135-8136,8155.

[7]杨薛康,海春旭,梁欣,等.枸杞提取物的抗氧化作用[J].第四军医大学学报,2007,28(6):518-520.

[8]沈自尹,郭为民,陈瑜.枸杞多糖调控老年大鼠T细胞凋亡及相关基因表达的研究[J].中国免疫学杂志,2002,18:628-630.

[9]徐曼妮,张欣文,徐思红,等.枸杞胶囊对果蝇的延缓衰老作用[J].同济大学学报·医学版,2001,22(4):6-7.

[10]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社. 2001：289-294.

[11]HAN S H,LEE H H,LEE I S,et al.A New Phenolic Amide from Lycium Chnense Miller[J].Archives of Pharmacal Research,2002,25 (4):433–437.

[12]BAE H C,CHO I S,NAM M S.Effects of the Biological Function of Yogurt Added with Lycium Chinence Miller Extract[J].J.Korean Soc.Journal of Animal Science and Technology,2005,47(6):1051-1058.

Effects of Chinese wolfberry(Lycium chinense Mill.）on the preservation and colonization of Lactobacillus

WANG Rui-jun
（Yichun University.College of Chemistry and Bioengineering,Yichun 336000，China）

To study the effects of Chinese wolfberry on the preservation and colonization ofLactobacillus.Preservation effect of Chinese wolfberry onLactobacilluscells were observed when MRS broth was supplemented with different concentration hydrolysate of Chinese wolfberry. Mice

orally antibiotics in the drinking water ad lib to induce microflora dysbiosis.On the sixth day,the mice cured byLactobacillusorLactobacilluscombinedLycium chinense.After five days,indicator bacteria were counted to determine the effectLycium chinenseon colonization ofLactobacillus.Cell grown on MRS containing hydrolysate of Chinese wolfberry showed a cell concentration is significantly higher than control group.Results demonstrated that the number ofLactobacilluswas significantly higher in the feces of the mice fedLactobacillusand Chinese wolfberry.Chinese wolfberry can promote the preservation and colonization ofLactobacillus.

Lycium chinenseMill;Lactobacillus;Preservation;Colonization

Q93-335

A

1001-2230（2012）03-0022-02

2011-10-19

由江西省教育厅(JXJG-10-14-13)，江西宜春科技局（JXYC 2010KNB003）资助。

王瑞君（1970-），女，讲师，主要从事微生物方面的研究。