薰衣草精油缓释固体分散体对失眠小鼠的治疗作用及对单胺类神经递质的影响研究

苏晓艳，毛小文，顾志荣，巩亦萍，马 薇，谢宇平*

（1.甘肃省人民医院 睡眠医学中心，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省人民医院 药剂科，甘肃 兰州 730000）

失眠症（Insomnia）是临床最为常见的睡眠障碍，指个体在客观条件允许的情况下对于睡眠的时间和质量不满足，并引起日间功能受损的一种主观体验。流行病学资料显示，中国有45.4%的被调查者在过去1 个月曾经历过不同程度的失眠［1］。目前，国内外指南均认为对于失眠症治疗首选认知行为治疗或其他非药物干预，如果治疗无效或患者拒绝时，才推荐药物治疗。药物治疗首选短、中效的苯二氮卓受体激动剂（Benzodiazepine receptor agonists，BZRAs）或褪黑素受体激动剂。西药治疗虽然起效迅速，短期疗效好，但存在成瘾性、耐药性、后遗效应、肝肾损害及停药后易反弹等问题［2］。中医药治疗失眠症的长期疗效较好，不良反应较少，大众接受度高，具有明显优势，目前常用的治疗方式包括中药、针灸、推拿按摩、针药结合、中西医结合等［3-4］等。

薰衣草精油（Lavender essential oil，LEO）是薰衣草（Lavandula angustifoliaMill.）的有效成分，已被《中华本草》［5］《维吾尔药材标准》［6］等收载。LEO 对于睡眠障碍、焦虑、偏头痛等具有较好的疗效，目前在国内主要用于芳香吸入疗法［7］，但存在疗效不确切、难以量化控制、使用不便、作用机制不明等问题，国外已有LEO 口服制剂用于临床［8］。项目组前期已将LEO 制备为口服的具有缓释功能的固体分散体，用于解决目前芳香吸入法治疗存在的问题，并达到缓慢释药、长久起效的作用。本研究探讨LEO缓释固体分散体对失眠小鼠的治疗作用及对单胺类神经递质（Monoamine neurotransmitters）的影响，为后续研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级昆明种小鼠60 只，雌雄各半，体质量18~ 22 g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2020-0001，实验动物使用许可证号：SYXK（甘）2020-0009。实验前均适应性饲养1周，自由饮水、进食。

1.2 药品与试剂

LEO缓释固体分散体（每g含薰衣草精油0.1 g），制法为：采用熔融法制备，将硬脂酸、聚乙二醇6000（PEG 6000）、单硬脂酸甘油酯以3∶5∶1 的配比置于70 ℃烘箱中，待完全熔融后滴加与单硬脂酸甘油酯同比例的LEO，充分搅拌混匀，然后迅速倾倒于冰浴不锈钢板上，涂成薄层，于-20 ℃冷却6 h，用药勺刮掉凝结的固体分散体，真空干燥，待脆化后研细，过80 目筛，即得。地西泮片（山东信谊制药有限公司，规格2.5 mg/片，批号191004）；氯化钠注射液（中国大冢制药有限公司，批号21E0802）；戊巴比妥钠（美国Sigma 公司，批号P3776）；对照品去甲肾上腺素（批号CHB201223）、多巴胺（批号CHB201225）、5-羟色胺（批号CHB201107）、高香草酸（批号CHB201206）、二羟基苯乙酸（批号CHB201113）、5-羟吲哚乙酸（批号CHB201117），均购于成都克洛玛生物科技有限公司；氯苯丙氨酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号K2011039）；高氯酸、乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）、柠檬酸、无水乙酸钠、二正丁胺、磷酸、B8离子对试剂均为分析纯，甲醇为色谱纯，均购于天津市大茂化学试剂厂；水为重蒸水。

1.3 仪器

1260 型高效液相色谱仪（美国Aglient 公司）；电化学检测器（荷兰Antec 公司）；BSA124S 万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；BSA2202S百分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；HH-6 型数显恒温水浴锅（西安超杰仪器有限公司）；SB25-12DTD 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；F6/10-8G 型超细匀浆机（上海佛鲁克液体机械制造有限公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher 科技公司）；台式高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.4 动物分组及模型复制

将60只昆明种小鼠（雌雄各半）随机分为正常对照组、PCPA模型组、地西泮阳性药物组、LEO缓释固体分散体高、中、低剂量给药组，每组10只，各组动物分笼饲养。除正常对照组外，其余各组小鼠腹腔注射（Intraperitoneal injection， ip）PCPA 混悬液（450 mg/kg），连续2 d，复制失眠模型，正常对照组ip等体积NS。第2 d ip PCPA 后0.5 h，ip 戊巴比妥钠（45 mg/kg），观察小鼠的睡眠持续时间（即翻正反射消失至恢复），睡眠持续时间显著降低表示建模成功。

1.5 给药方法

第2 d ip PCPA 后，阳性药物组灌胃（Intragastric administration， ig）地西泮片（0.92 mg/kg），低、中、高剂量给药组ig LEO缓释固体分散体（剂量分别为1.67、3.34、6.68 g/kg），正常对照组与PCPA模型组按比例ig同体积NS，1次/d，连续7 d。

1.6 体质量变化考察

在实验前及造模成功后每天固定时间分别称定各组小鼠的体质量，连续7 d。

1.7 睡眠时间测定

第6 d ig 60 min 后，各组小鼠ip 戊巴比妥钠（45 mg/kg），测定小鼠的睡眠持续时间（翻正反射消失至恢复的时间）。

1.8 行为学测试

第7 d ig 后60 min，对全部小鼠采用旷场实验进行行为学测试。观察并记录小鼠在3 min 内的水平活动得分、垂直活动得分及修饰活动得分。水平活动得分指小鼠穿越底面的方格数，3 爪以上跨入即可；垂直活动得分指小鼠前肢离地、后肢站立的次数；修饰活动得分指小鼠理毛、抓耳挠腮等行为次数与粪便数之和［9］。

1.9 高效液相色谱—电化学检测系统测定脑组织内单胺类神经递质及代谢产物

1.9.1 组织样本采集与制备

末次给药24 h 后，麻醉处死，快速断头摘取各组小鼠大脑海马及脑干组织，加3 倍量0.1 mol/L 高氯酸（HClO4）溶液（内含0.3 mmol EDTA，0.5 mmol Na2SO3）作为匀浆液于冰浴中匀浆，离心2 次（4 ℃，14 400 × g，10 min），取上清，以0.45 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液即得。同法不加入组织样本制备阴性对照液。

1.9.2 混合对照品溶液配制

分别精密称取去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）、二羟基苯乙酸（Dihydroxy-phenylaceticacid，DOPAC）、多巴胺（Dopamine，DA）、5-羟吲哚乙酸（5-Hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）、高香草酸（Homovanillic acid，HVA）、5-羟色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）对照品7.11、18.56、6.62、9.70、5.34、7.86 mg，置于100 mL 量瓶中，以0.1 mol/L HClO4溶液溶解并定容，再取1 mL 上述溶液置于100 mL量瓶中，以0.1 mol/L HClO4溶液溶解并定容，配置成含NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 分别为0.711、1.856、0.662、0.970、0.534、0.786 mg/L 的混合对照品溶液。

1.9.3 色谱条件

采用高效液相色谱—电化学检测系统检测。Quattro 4 C18色谱柱（150 mm × 2.1 mm，3 µm），电化学检测器检测电压为+0.75 V，流动相为缓冲盐溶液-甲醇（V/V =89∶11），等度洗脱，流速1 mL/min，进样量20 µL。其中，缓冲盐溶液内含50 mmol的柠檬酸-乙酸钠，1 mmol B8 离子对试剂，1.8 mmol二正丁胺，0.3 mmol EDTA-Na2，用浓磷酸调pH 为3.3。结果见图1。

图1 单胺类神经递质及其代谢产物的HPLC图谱Fig. 1 HPLC chromatograms of monoamine neurotransmitters and their metabolites

1.9.4 工作曲线制备

取“1.9.2”项下混合对照品溶液，分别进样1、5、10、20、30、40 µL，按“1.9.3”项下的色谱条件测定，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制工作曲线，采用“外标标准曲线法”计算含量。工作曲线见表1。

表1 单胺类神经递质及其代谢产物的工作曲线Tab. 1 Working curves of monoamine neurotransmitters and their metabolites

1.9.5 精密度考察

取同一供试品溶液，按“1.9.3”项下色谱条件，连续进样6 次，计算得NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 峰面积的RSD 分别为2.39%、2.25%、3.37%、4.08%、1.94%、4.34%，结果表明仪器精密度良好。

1.9.6 重复性考察

取同一供试品溶液6 份，按“1.9.3”项下色谱条件重复测定，记录NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 的峰面积，计算得各成分含量的RSD 分别为1.51%、4.52%、2.53%、4.38%、1.33%、2.15%，结果表明该方法重复性较好。

1.9.7 稳定性考察

取同一供试品溶液，按“1.9.3”项下色谱条件，分别于0、3、6、12、18、24 h 进行测定，计算得NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 峰面积的RSD 分别为1.38%、0.94%、2.61%、1.52%、3.82%、2.57%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

1.9.8 回收率考察

取已知含量的样品，分别加入高、中、低浓度的对照品溶液，按“1.9.1”项下方法处理样品，按“1.9.3”项下色谱条件测定，计算得NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 的平均回收率分别为104.55%、98.12%、103.78%、97.43%、95.12%、102.27%，RSD 分别为2.58%、1.05%、3.52%、1.82%、2.39%、3.53%，结果表明方法回收率良好。

1.10 数据统计与分析

2 结果

2.1 LEO对失眠小鼠体质量的影响

结果见表2。实验前各组的体质量无显著性差异（P> 0.05）。正常对照组的体质量随实验时间延长而逐渐增加，并从实验第2 d 开始具有统计学意义（P< 0.01）。ip PCPA的其余各组的体质量均呈先下降后上升的趋势。与实验前相比，阳性药物组与LEO 中剂量组的体质量恢复从ig 第4 d 开始显著增加（P< 0.05 或P< 0.01），LEO 高剂量组从ig 第3 d开始显著增加（P< 0.05），LEO 低剂量组从ig 第5 d开始显著增加（P< 0.01）。与PCPA 模型组比较，高剂量给药组ig 第4 d 开始体质量增加显著（P< 0.01），表明LEO 缓释固体分散体能够显著改善ip PCPA所致的失眠小鼠的体质量下降。

表2 LEO对失眠小鼠体质量的影响Tab.2 Effect of LEO on body weight of insomnia modle mice

2.2 LEO对失眠小鼠睡眠时间的影响

结果见表3。与PCPA 模型组相比，ig 第6 d 时，阳性药物组与LEO 高、中、低剂量组的睡眠持续时间均显著延长（P< 0.05 或P< 0.01），且睡眠时间随着LEO 的剂量增加有增加趋势，表明LEO 缓释固体分散体具有明确的镇静催眠作用，但增加睡眠时间的效果均不及阳性药物组。与正常组相比，ig 第6 d时，阳性药物组和LEO 高、中剂量组的睡眠持续时间均显著延长（P< 0.01）。ig第6 d时，PCPA 模型组的睡眠持续时间低于正常对照组，出现失眠症状，但无显著性差异，可能是PCPA 作用已下降或小鼠已对失眠产生了一定的适应性。

表3 LEO对失眠小鼠睡眠时间及行为学的影响Tab. 3 Effect of LEO on sleep duration and behavioral activity of insomnia modle mice

2.3 LEO对失眠小鼠行为学的影响

结果见表3。与正常组比较，ig 第7 d 时，PCPA模型组水平活动得分和垂直活动得分均显著减少（P< 0.01）。与PCPA模型组相比，阳性药物组、LEO高、中剂量组的水平活动得分与垂直活动得分均显著增加（P< 0.05 或P< 0.01），LEO 低剂量组的水平活动得分与垂直活动得分均无显著性差异；各组的修饰活动得分均无显著性差异。结果表明，LEO 缓释固体分散体能够改善PCPA 所致失眠模型小鼠的水平活动次数和垂直活动次数的下降。

2.4 LEO 对失眠小鼠脑组织内单胺类神经递质的影响

结果见表4 ~ 5。与正常对照组相比，PCPA 致失眠模型小鼠的海马、脑干组织中DA 含量均显著升高（P< 0.01），而脑干组织中NE 含量也显著升高（P< 0.01）；海马组织中NE、5-HIAA、HVA、5-HT 含量均显著降低（P< 0.01）。与PCPA 模型组相比，阳性药物组、LEO高、中、低剂量组小鼠的海马、脑干组织中5-HT 含量均显著升高（P< 0.01），DOPAC、DA含量均显著降低（P< 0.01）；阳性药物组、LEO 高、中、低剂量组小鼠的海马组织中HVA 含量显著降低（P< 0.01），脑干组织中NE含量显著降低（P< 0.01）。失眠小鼠海马及脑干组织DA 含量增多，海马组织中5-HT 含量减少，LEO 缓释固体分散体高、中、低剂量对此均有显著疗效，说明各给药组可能通过降低海马及脑干组织中DA 含量来增加海马组织中5-HT的含量而治疗失眠。

表4 LEO对失眠小鼠海马组织中单胺类神经递质及代谢产物的影响Tab. 4 Effect of LEO on monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampus of insomnia modle mice

表5 LEO对失眠小鼠脑干组织中单胺类神经递质及代谢产物的影响Tab. 5 Effect of LEO on monoamine neurotransmitters and their metabolites in brainstem of insomnia modle mice

3 讨论

根据《中华本草》记载，成人口服薰衣草的每日用量为3 ~ 9 g，本实验所用LEO 在原药材中的含量为0.62 mL/100g。以70 kg 成人口服薰衣草的日用量为9 g，根据等效剂量系数9.1［10］，换算可得小鼠的LEO 给药剂量为508 mg/kg，因此设定小鼠的LEO低、中、高给药剂量分别为250 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg，对应LEO 缓释固体分散体分别为1.67、3.34、6.68 g/kg。

单胺类神经递质在睡眠调节中发挥着关键作用，是目前睡眠障碍相关疾病研究及药物研发的重要方向之一。大脑皮层、脑干和海马组织中都含有单胺类神经递质。现有研究表明，单胺类神经递质NE、DA、5-HT 主要通过作用于脑干区域的突触活动来调节睡眠-觉醒周期［11］，因此本研究选取小鼠的海马和脑干作为失眠研究部位。

本研究选择单胺类神经递质及代谢产物NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT 作为研究指标。其中，5-HT 与DA 是目前研究的热点。5-HT 能够促进睡眠，其主要代谢途径是5-HIAA。DA 是兴奋性神经递质，浓度升高可导致觉醒增加、睡眠减少，而HVA 与DOPAC 是其主要代谢产物，HVA 同时也是儿茶酚胺类NE的代谢产物［12-13］。

本研究表明，LEO 缓释固体分散体具有明确的镇静催眠作用，其机制可能与升高脑组织中5-HT含量、降低DA 含量有关，与目前报道的结果相一致。与PCPA 模型组相比，阳性药物组对小鼠的体质量改善无统计学意义（P> 0.05）；而高剂量给药组ig 第4 d 开始体质量显著增加（P< 0.01），表明LEO缓释固体分散体能够显著改善ip PCPA 所致的失眠小鼠的体质量下降，其原因可能与LEO 具有增加食欲的作用有关［14］。

相比西药氯硝西泮、艾司唑仑、佐匹克隆等镇静催眠类药物，LEO 具有作用稳定、持续时间长、对认知功能起到保护作用、不具有宿醉样感觉和成瘾性等明显优点，主要通过抑制中枢神经系统起到镇定安神作用［7］。不同国家、不同类型失眠患者的相关研究均证实了这一点，LEO 常用的方式包括芳香吸入、精油按摩及口服［15］。目前研究认为，口服LEO的镇静催眠作用由其抗焦虑作用所介导，代表制剂为Silexan 胶囊［8］。在临床上，LEO 芳香疗法常结合其他治疗使用，如结合分阶段行为转变治疗可改善睡眠质量，促进腰椎功能恢复［16］；结合齐拉西酮治疗能够有效提高精神分裂症缓解期患者的认知功能，改善其睡眠质量［17］。