自毒物质降解菌缓解药用植物连作障碍的作用及机制研究进展

张博洋，陈彦宏，栗锦鹏，原静静，黄 储，何明月，王惠珍，2*

（1.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2.西北中藏药省部共建协同创新中心，甘肃 兰州 730000）

近年来，面对日益增长的物质需求和自然条件的限制，许多植物都存在不同程度的连作障碍问题，严重影响产量与品质，成为限制农业可持续发展的重大生产问题之一［1-2］。尤其是药用植物受到立地条件、气候条件和土地利用等多种因素的限制，适宜种植区域比较狭窄，因此连作现象更为突出。连作障碍的发生会使药用植物生长发育受到抑制，并影响次生代谢产物的合成，最终导致产量和品质下降。如玄参连作会出现死苗、烂根及病害等现象，对玄参的产量和品质影响显著［3］；当归连作会导致当归麻口病严重，连作田通常每年损失在30%以上，有些地块甚至绝收［4］；长期连作导致黄连病害频发，特别是根腐病，年均发病率10%～20%，严重地块甚至绝收［5］；百合连作会导致枯萎病普遍发生，植株根部腐烂，地上部分枯萎死亡，严重影响百合产量和品质［6］。研究表明，自毒物质所引发的自毒作用，是造成药用植物连作障碍的原因之一，而施用自毒物质降解菌是缓解自毒作用的一种重要措施［7］。因此，本文归纳总结药用植物连作障碍防治措施、自毒物质降解菌种类及降解途径、降解菌对连作条件下植物及土壤环境的影响等，目的是从现有科学研究及文献资料中阐释自毒物质降解菌在缓解药用植物连作障碍中的作用及其机制，并对自毒物质降解菌研究中存在的问题和未来发展方向进行分析，更为从生理及分子层面深入揭示自毒物质降解菌及其作用机制提供理论依据。

1 连作障碍及其防治措施

连作障碍是指在同一土壤上连续种植同科或同种作物时，即使在正常生长管理下，也会出现生长不良、产量和品质下降、病虫害增加等问题，也可称为再植病害或再植问题［8-9］，是一种普遍存在的农业生产现象，在我国又被称作“重茬问题”。连作障碍是由多种因素相互影响造成的，是“植物-土壤-微生物”3 个系统共同作用的结果［10］。综合近年来的研究成果，连作障碍发生原因大致可归纳为根系分泌自毒物质诱发的自毒作用、需肥特性导致的土壤养分亏缺和根际微生态破坏导致的土传病害加重［11-13］。其中自毒作用最为重要且研究较为深入。综合已有研究表明，自毒物质是一类由植物自身产生、能够影响植物生长发育的物质，其种类繁多，主要有酚酸类及其衍生物、黄酮类及其衍生物、生物碱三大类，还包括大分子有机物如酶类、非蛋白氨基酸和多肽以及小分子物质醛类、醌类、醇类、酮类等［14］，且造成连作障碍的作用机理存在异同（见表1）。

表1 药用植物主要自毒物质及其作用机理Tab.1 Main autotoxic substances in medicinal plants and their mechanisms of action

防治或缓解药用植物连作障碍的措施主要有农业防治、化学防治和生物防治，其中增施菌肥是最普遍且有效的生物防治措施之一［45-49］。在此基础上，研究者又结合自毒物质从土壤和植物中筛选菌株（自毒物质降解菌）反作用于连作土壤，不仅具有一般菌肥功能，还可以降解土壤中的自毒物质、优化土壤中微生物群落、改良土壤微环境，起到生物防治及促进植物生长发育的目的［50］。随着研究的深入，利用自毒物质降解菌缓解药用植物自毒作用的研究逐渐被重视［50-52］，并从降解菌的种类及各自降解途径、缓解连作障碍的作用及机制等方面进行了深入研究。

2 自毒物质降解菌的种类与降解途径

自毒物质降解菌是指从植物体内或根际土壤中筛选到的、能分解自毒物质的菌株［53］。通常先在实验室条件下，以自毒物质为唯一碳源，分离筛选。这些菌株具有降解自毒物质的潜力，进而可缓解连作障碍。因此接下来将从自毒物质降解菌的种类与降解途径两方面进行归纳总结。

2.1 自毒物质降解菌的种类

2.1.1 细菌

在自然界中存在多种对自毒物质有降解作用的细菌菌株［54-55］。有研究显示，从土壤中筛选出的绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis） ZH2 对自毒物质对羟基苯甲酸降解率达97 %，且能缓解对羟基苯甲酸对作物的抑制作用［56］；从三七连作土壤中筛选分离出三七皂苷降解细菌8 株，其中嗜麦芽糖寡养单胞菌DSY2B8 和绿针假单胞菌DSY3B6 具有较强降解效果［57］。另外，从三七根际土壤中分离获得91株菌种，其中蒙氏假单胞菌PM-41能有效降解三七皂苷类自毒物质，且具有缓解三七连作障碍的潜力［53］。有研究发现，以苯甲酸为唯一碳源，通过浓度驯化，筛选得到对番茄幼苗中苯甲酸降解率达95%、91%和90%的菌株3 株，经鉴定分别为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌、链霉菌属吸水链霉菌、纳西杆菌属耐碱纳西杆菌。3 株菌株对连作番茄苗期生长具有显著促进效果［58］。从连作土壤中分离筛选得到一株高效降解肉桂酸的细菌 R30，鉴定为微小杆菌（Exiguobacterium sp.），不但可高效降解肉桂酸，还对如阿魏酸、苯甲酸等其他酚酸类物质表现出一定的降解能力［59］。从香草兰连作种植园根际土壤筛选到3 株可降解酚酸类自毒物质的细菌菌株ZD-4、ZH-19、ZH-20，经鉴定ZD-4 为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、ZH-19 为炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、ZH-20 为解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens），其中ZH-20 对对羟基苯甲酸的降解能力较强［60］。从花生根际分离得到的克雷伯氏菌ZH07，在其基因组中发现了大量可降解芳香族化合物的基因，因此推测联合施用ZH07 具有促进花生种子萌发和幼苗生长的能力［61］。

2.1.2 真菌

自然界中不仅有降解自毒物质的细菌，还存在一些真菌同样也有降解自毒物质的作用。于淑婷等［62］从棉田土壤中筛选出3株可同时降解邻苯二甲酸二丁酯及邻苯二甲酸二辛酯的高效降解真菌PAE1、PAE6、PAE8，分别鉴定为菌核生枝顶孢霉、辐毛鬼伞、耐盐枝孢菌，并通过土壤试验证明3株真菌均具有修复邻苯二甲酸二丁酯及邻苯二甲酸二辛酯污染土壤的作用。孙秀等［63］从连作黄瓜根际土壤中筛选得到1 株肉桂酸降解真菌，初步鉴定为黑曲霉，其降解率可达99%，并通过土培试验表明可缓解黄瓜自毒作用。王洁等［60］筛选得到 3 株可降解酚酸类自毒物质的真菌菌株BM-5、FD-21和BD-8。16S rRNA 和 ITS 序列比对结果表明， BM-5 为黄丝曲霉（Talaromyces sp.）、FD-21 为青霉（Penicillium sp.）、BD-8 为桔青霉（Penicillium citrinum）。3株降解菌对连作土壤中的对羟基苯甲酸等酚酸类自毒物质均有一定的降解能力，其中BD-8 对苯甲酸的降解率最高，可达到86.52%。从山地栽培人参中分离的内生黄绿木霉 PG87 具有降解人参自毒物质、抑制六种人参病原菌菌丝生长等生物防治作用［64］。从根际土中分离提取的一种丛枝菌根真菌Glomus mosseae 具有减轻植株的自毒效应，降低自毒物质对幼苗生长的不利影响［65］。

2.1.3 放线菌

放线菌并不比细菌和真菌研究的深入。其中，从土壤中筛选得到的淡紫褐链霉菌Act11 和Act12对苯甲酸和对羟基苯甲酸有较强的降解能力，将其制剂后施加于草莓幼苗，对草莓根系生长和新根形成有明显促进作用［66］。在以阿魏酸为唯一碳源的培养条件下，筛选得到25、28、Z30 3 株对阿魏酸具有较好降解效果的放线菌株，经16S rDNA 序列测定，25 号放线菌为淡紫褐链霉菌，28 号放线菌为球孢链霉菌球孢亚种，Z30 为链霉菌，三株菌种降解率最高可达94.3%，可降解西瓜自毒物质，具有缓解西瓜连作障碍的能力［67］。

上述内容表明，无论从根际土壤还是植物材料中均能够分离出具有缓解自毒作用的自毒物质降解细菌、真菌和放线菌［68］。因此自毒物质降解菌的研究和应用对缓解药用植物连作障碍具有十分重要的意义。

2.2 自毒物质降解菌的降解途径

降解菌对自毒物质的降解途径有2种，即直接代谢作用和共代谢作用，二者的区别主要在于降解菌能否降解自毒物质来提供能量维持自身生长能量［69］。直接代谢作用是指降解菌通过降解自毒物质获取自身生长所需能量，可将自毒物质作为唯一碳源；共代谢作用是指降解菌在其他碳源存在的情况下，才能完成对自毒物质的降解作用［70］。

小分子量物质可通过直接代谢作用被降解菌降解，而高分子量物质如多环芳烃则—般很难通过直接代谢作用被降解菌降解，往往通过共代谢方式降解［71］。根际土壤中自毒物质常以多种类型并存出现，因此共代谢作用普遍存在于自毒物质的降解过程中，且已有比较明确的降解机理［72］。例如，在共代谢过程中，降解菌以分泌酶来促进自毒物质降解［73］。因此，酶是共代谢作用发生的关键，且关键酶活性直接影响自毒物质降解效果。当多种自毒物质存在时，某些自毒物质能够作为降解菌的碳源或氮源，促进共代谢作用，进而促进自毒物质降解。降解菌共代谢过程中的关键酶大致相同，好氧类降解菌的关键酶是双加氧酶和单加氧酶，厌氧类降解菌的关键酶是还原酶［74-75］，但因为共代谢过程具有复杂性和未知性，所以其关键酶的产生机制尚无定论。

3 自毒物质降解菌在缓解连作障碍中的作用机制

现有文献显示，自毒物质降解菌通过对自毒物质的降解作用、对病原微生物生长的抑制作用、对植物的促生作用、对药用植物有效成分合成和积累的促进作用及对土壤环境的优化作用等缓解连作障碍。

3.1 降解菌对自毒物质的降解作用

研究表明，自然界中存在可以降解自毒物质的微生物群落。因此，可通过以自毒物质为单一营养源筛选菌株，达到降解植物体产生的自毒物质，使其转化为无害物质，从而减轻甚至克服自毒作用的效果［76］。外源施加自毒物质降解菌是降解酚酸类自毒物质的重要方法之一，尤其是对瓜类植物根系分泌的自毒物质显现出了良好的降解效果［77］。有研究发现，外源加入的有益微生物齿孢青霉F-0056可有效缓解阿魏酸积累造成的黄连连作障碍［22］。亦有研究表明，金黄杆菌的存在改变了黄酮类物质的渗出模式，使根系不再分泌槲皮素和柚皮素［78］。因此，在生产上，常对连作后的土壤采用施加生物菌剂的方式来缓解连作障碍。

3.2 降解菌对病原微生物生长的抑制作用

自然环境中，某些真菌与细菌通过分泌酶及抑菌物质而抑制病原微生物生长。例如，连作土壤中的菌株LE16，可分泌出蛋白酶、溶菌酶和一些热稳定的抗菌物质而有效拮抗金黄色葡萄球菌、柑橘炭疽病菌、烟草疫霉等病原微生物的生长［79］。刘晓姣等［80］发现烟草根际微生物能产生抑制青枯雷尔氏菌生长的挥发性有机物，从而减少青枯菌的数量，降低烟草发病率。3 株阿魏酸降解放线菌对供试4种病原菌有一定的拮抗作用，由此推知其在降解阿魏酸的同时，也能合成具有抗枯萎病菌的活性物质，对西瓜枯萎病原菌有一定的抑制作用。

3.3 降解菌对植物的促生作用

李冠喜等［81］在松树根际土壤中分离出一种多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9，该菌种不但对供试的多种自毒物质具有较强的降解能力，而且可使杨树幼苗根系超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）及过氧化物酶（Peroxidase，POD）的活性增加，使根系内丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量减少，从而提高根系活力，促进植物生长。黄瓜根际土中一种恶臭假单胞菌对黄瓜幼苗生长及土壤酶活性有促进作用，同时还可以增强叶片中抗氧化酶活性［63］。降解菌还可协助溶解土壤中的难吸收物质使其可被植物吸收利用，进而促进植物生长发育［82-83］，解磷或溶磷微生物通过自身分泌酸和酶将难溶态磷转化或活化为有效态磷［84-85］，从而被植物吸收［86］，因此，从根际土壤中筛选高效解磷菌株，并开发出生物肥料制剂已成为一种高效、环保、经济的活化土壤磷素的有效生物途径［87］。亦有研究表明，自毒物质降解菌可以通过缓解药用植物连作障碍，并同时促进药用植物中有效成分积累，进而达到药用植物增产增效的效果［17］。

3.4 降解菌对药用植物有效成分合成和积累的影响

中药材在特定的生长生态环境下，会受到环境因素和生物因素的共同影响，其中微生物环境对药材道地性的形成有着举足轻重的作用［88］。部分药用植物内生菌不但可以调节植物正常生长，亦可产生与宿主植物相同的药效成分，有助于药用植物有效成分的产生与积累。程玉鹏等［89］研究发现，红豆杉内生真菌能够产紫杉醇，长春花内生真菌可产长春新碱，以上成分均与原植物次生代谢产物相同。近年来，从植物内生菌中分离得到多种活性化合物，除与宿主植物相同的产物外，还发现具有新颖结构的天然产物［90］。张武德等［91］从丹参内生菌中分离出8个新型的化学成分，这些物质具有抗癌，抗病毒等作用。由此可见，药用植物内生菌是新型天然产物挖掘与筛选的重要来源之一。

微生物菌群作为微生物生态的一个重要组成部分，既可从植物体内部对药用植物的生长产生影响，又可通过改良植物根际土壤环境促进药用植物有效成分的合成与积累。因此，从微生物的角度阐明植物次生代谢产物的形成和积累机制将是一种新的研究思路。

3.5 降解菌对土壤环境的优化作用

细菌、放线菌、真菌、藻、原生动物和病毒等土壤微生物，对于土壤肥力形成、能量循环和土壤中有机成分分解等过程起着重要作用［92-93］。植物根际作为一个特殊的生态环境，其周围存在的微生物数量和种类较多，且其繁殖和分布受根系影响，表现出明显的根际效应［94］。自毒物质降解菌不仅会通过降解自毒物质促进植物生长，同时也可以通过改变土壤中微生物群落结构来提高土壤肥力［95］。药用植物方面的相关研究甚少，大田作物研究较多，例如有研究发现，从小麦根际土壤中分离出降解自毒物质Ca3（PO4）2的菌株JT-1，外部接种JT-1 菌种可明显增加土壤中微生物的数量和种类，并提高土壤中酶活性［96］。有些菌种可通过多种方式优化土壤环境，例如，可通过分解难溶态磷提高土壤中速效磷含量、激发土壤酶活性、引起微生物群落改变等来优化植物生长微环境［97］。

4 思考与展望

利用微生物技术解决药用植物根系土壤中自毒物质的积累，是避免连作障碍、保护农业生态环境的重要措施。现如今，自毒物质降解菌在药用植物栽培中的应用被寄予厚望。作为一种具有降解能力的微生物，降解菌可以将自毒物质分解为小分子有机物或更为简单的无机物，进而缓解药用植物连作障碍，或为植物生长发育提供养分。

在药用植物栽培中，降解菌的应用能够有效地缓解药用植物连作障碍，进而促进植物的生长和发育。此外，降解菌还可以促进药用植物对土壤中的营养成分的吸收来提高药用植物的产量。因此筛选高效降解自毒物质的菌株，并阐明降解和转化机制，是连作障碍研究的重要内容。其次，现有研究主要集中于某种降解细菌对单一或少数自毒性物质的降解和转化，但在生产中，一种作物根部往往有多种自毒物质共同存在，特别是对于结构相对复杂的自毒物质，由于其取代基的数量、位置和类型不同，降解难度大，降解机制尚不明确，因此，筛选和培养适合降解各种自毒物质的降解菌可能是今后研究的方向。此外，对于不同种类的降解菌，还应探索物种之间的关系，以避免物种之间的拮抗。

自21 世纪以来，我国药用植物需求不断增加，规模化和集约化种植面积与日俱增，带来的连作障碍问题日益突出。在连作障碍土壤中自毒化感物质往往是几种甚至是十几种共同存在的，对于一些常见的自毒物质如对羟基苯甲酸、香豆酸、苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸等，其降解需要多种微生物及多种降解途径共同发挥作用，因此筛选高效且可同时降解多种自毒物质的降解菌是利用生物方法缓解连作障碍的关键。自毒物质降解菌可通过多种途径缓解药用植物连作障碍，因此，筛选多功能自毒物质降解菌也是缓解连作障碍的重要方法之一，但是自毒物质降解菌在实际应用过程中仍存在着有效菌株在土壤中存活期短、效果不稳定、作用效果单一等问题，制约其在连作障碍治理中的应用，因此筛选效果稳定的微生物菌群是生物方法治理成功的关键。

在未来，自毒物质降解菌在药用植物栽培中的应用将会更加广泛。例如，通过基因工程手段改造菌株，使其具有更强的分解能力和更高的底物广谱性，从而更好地为药用植物的栽培服务。自毒物质降解菌在药用植物栽培中的应用具有广阔的前景，通过对其的深入研究，可以更好地了解降解菌的特性和作用机制，从而为药用植物克服连作障碍提供更好更优质的解决方案。