洋葱多糖的提取及其抗氧化、美白活性研究

聂 韡，任荧莹，单承莺，刘 薇，李继国，马世宏

（1.中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所，江苏 南京， 211111；2.南京苗邦美业企业管理有限公司，江苏 南京， 210000）

洋葱（Allium cepaL.），别名球葱、圆葱、玉葱、葱头、荷兰葱、皮牙子等，是百合科（Liliaceae）葱属（AlliumL.）多年生草本植物，原产于亚洲西部，我国多地均有种植，根据其皮色可分为白皮、黄皮和紫皮三种［1］。洋葱中的活性成分有含硫化合物、类黄酮类化合物、多糖、酚类化合物、甾体皂甙类化合物等，具有抗氧化、抑菌、预防肿瘤、降低血糖血脂、免疫调节等多种健康功能［2］。我国洋葱资源十分丰富，在食品、药品、美容保健等领域应用潜力巨大，但目前对其食药用价值仍然缺乏系统化、规模化的开发利用，对洋葱活性成分的基础研究和产品开发尚待进一步深入［3］。

常用的多糖提取方法包括热水提法、稀碱水溶液提取法、酶解法、超声波辅助酶提法等。热水提法利用多糖在水溶液中的溶解度较高的原理进行分离且该法操作简单、应用广泛；稀碱水溶液提取法适用于酸性多糖的提取但对温度要求高；酶解法反应温和、特异性好，但需控制合适的反应条件从而使酶保持较高的活力［4］。考虑到生产的适用性、操作的简易性、多糖的提取率等因素，本文选择通过水提醇沉法制得洋葱粗多糖后考察其抗氧化和美白效果，摸索洋葱粗多糖的功效和有效作用浓度，以期为推动洋葱中有效物质的开发与利用提供参考。

1 实验材料

1.1 主要材料与试剂

紫皮洋葱，购于超市。

野生型AB 品系斑马鱼，购于南京一树梨花生物科技有限公司。

对照品：α-熊果苷购自广州诺彦生物科技有限公司。

试剂：无水葡萄糖、抗坏血酸、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、无水乙醇、硫酸、苯酚、水杨酸、硫酸亚铁、30%过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、焦性没食子酸、脱氧胆酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司；左旋多巴购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器

Zf-103-三层单排独立养殖单元（南京一树梨花生物科技有限公司）；MZ71-体视显微镜（广州市明美光电技术有限公司）；SpectraMax M2-全波长酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）；JW-2017HR-高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；ZXSD-A1090-生化培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；RE100-Pro-旋转蒸发仪（北京大龙兴创实验仪器股份公司）；MX-S-可调式混匀仪（北京大龙兴创实验仪器股份公司）；FA2004HM-万分之一天平（常州万泰天平仪器有限公司）；DHG-9143 BS-Ⅲ-电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；DZTW/5 000 mL-调温电热套（上海力辰邦西仪器科技有限公司）。

2 试验方法

2.1 洋葱多糖的提取

将鲜洋葱切成小片后置于50℃恒温干燥箱中干燥，粉碎，取150 g洋葱干燥粉末于圆底烧瓶中，按1∶20 的料液比加入去离子水，100℃沸水提取3 h。提取完成后自然冷却至室温，四层纱布过滤并弃去残渣，旋转浓缩至200 mL。将800 mL 95%乙醇缓慢加入200 mL 浓缩液中析出沉淀，静置过夜，真空抽滤，得到灰白色沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤3遍后转移至蒸发皿中，冷冻干燥得灰白色洋葱粗多糖粉末11.2 g。

2.2 标准曲线的测定

采用硫酸-苯酚法测定洋葱多糖的总糖含量，该方法的原理是多糖经浓硫酸水解后转化为单糖，并快速脱水成糠醛衍生物，脱水产物与苯酚相互作用后形成橙黄色化合物，于490 nm 处有紫外吸收［5］。

参考庞逸敏等［6］方法测定并稍作修改，在10 mL容量瓶中加入精密称取的无水葡萄糖粉末0.1 g，用去离子水定容至刻度线后摇匀制成10 mg/mL 的葡萄糖储备液。精密吸取1 mL葡萄糖储备液于10 mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度线后摇匀制成1 mg/mL 的葡萄糖稀释液。精密吸取50、65、75、90、100 µL 葡萄糖稀释液于具塞试管中，加水补至1 mL（以1 mL 去离子水为空白对照），加入0.5 mL 8%苯酚溶液和2.5 mL 浓硫酸后轻轻震摇使管内溶液均匀混合，沸水浴20 min 后置于冰浴中冷却至常温，立即在490 nm 处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线［7］。

2.3 多糖纯度测定

称取洋葱粗多糖固体0.1 g 于10 mL 容量瓶中，用去离子水定容至刻度线后摇匀制成10 mg/mL 的洋葱粗多糖水溶液，吸取0.1 mL 上述水溶液于离心管中并补水至5 mL，混匀后按2.2.1 中的方法操作，吸取1 mL待测样品溶液于具塞试管中，依次加入苯酚和硫酸溶液并混匀，沸水浴20 min 后于490 nm 处测定吸光度。

2.4 洋葱多糖抗氧化能力测定

2.4.1 羟基自由基的清除率测定

利用Fenton 反应使H2O2在Fe2+的催化下生成大量羟基自由基，反应生成的羟基自由基被体系中的水杨酸捕捉后产生紫色化合物，其在510 nm 处有最大吸收峰，吸光度的大小与羟基自由基的含量成正比，若样品溶液具有较好的羟基自由基清除能力，有色物质的生成会减少［8］。

参考陈琳琳等［9］方法测定并稍作修改，在具塞试管中依次加入9 mmol/L 水杨酸溶液1 mL、9 mmol/L硫酸亚铁溶液1 mL、样品溶液1 mL，加水补至9 mL后混匀，最后加入9 mmol/L H2O2溶液1 mL 启动反应，将上述反应液置于37℃水浴锅中加热30 min 后于510 nm 处测定吸光度，以维生素C 为阳性对照比较待测样品的羟基自由基清除能力大小。

清除率（%）=［A对照-（A样-A0）/A对照］×100

式中，A对照为样品溶液改成去离子水后的吸光度，A样为待测样品吸光度，A0为H2O2溶液改成去离子水后的吸光度。

2.4.2 超氧阴离子自由基的清除率测定

碱性条件下，邻苯三酚自氧化释放出超氧阴离子（·O2

-）并生成黄色中间产物，超氧阴离子清除剂能与·O2

-结合从而减少中间产物的累积，进而降低325 nm处的吸光度［8］。

吸取2.25 mL pH = 8.2 的10 mM Tris-HCl 溶液于离心管中并置于25℃水浴锅中温育20 min，随后加入0.5 mL 待测样品溶液和0.2 mL 3 mM 邻苯三酚溶液，混匀后置于25℃水浴锅中反应5 min，用0.5 mL 10 mM HCl 溶液终止反应，摇匀后放置3 min，在325 nm 的波长下测定吸光度，以维生素C为阳性对照比较待测样品的超氧阴离子自由基清除能力大小。

清除率（%）=［1-（A样-A0）/A对照］×100

式中，A样为待测样品吸光度，A0为邻苯三酚溶液改成去离子水后的吸光度，A对照为样品溶液改成去离子水后的吸光度。

2.5 洋葱多糖美白功效测定

斑马鱼与人类基因相似度达87%，可作为生物活性筛选的模式生物为临床应用提供依据，其作为模式生物具有耗时短、操作简单、成本低、对环境友好等特点，与此同时，斑马鱼产卵量高，鱼胚具有光学通透性，可通过在体视显微镜下观察体内黑色素沉积的量进行定性分析［10-11］。黑色素生成过程中酪氨酸酶起决定性作用，样品溶液通过抑制酪氨酸酶的活性进而减少黑色素在体内的沉积，对暴露于不同浓度样品溶液中72 hpf（受精后72 h）的幼鱼进行黑色素生成抑制和酪氨酸酶活性抑制检测，可作为样品美白功效的定量分析。

2.5.1 胚胎准备

选取大于四个月的性成熟的斑马鱼按1∶2的雌雄比置于带有挡板和胚胎分离内缸的产卵盒中避光过夜培养，次日早晨打开光源，抽开产卵盒挡板使之进行交配，交配1 h 后，收集产卵盒底的胚胎于烧杯中，用标准稀释水清洗至杯内无异物后，放入28℃恒温培养箱中孵育6 h。

2.5.2 黑色素生成抑制检测

用塑料吸管随机挑选6 ~ 8 hpf（受精后6 ~ 8 h）发育正常的胚胎于6 孔细胞培养板中，每孔加入胚胎30 枚，用养殖水清洗鱼胚2 次后吸干孔内水分，每孔加入5 mL不同浓度的待测样品稀释液，盖上盖板后置于28℃恒温培养箱中静置孵育，在24 hpf 和48 hpf 时各更换一次培养液，弃去中心泛白的鱼卵并于2倍物镜的体视显微镜下观察鱼胚黑色素生成状态。各浓度设置3 组平行，以标准稀释水为空白对照、0.5 mg/mL熊果苷标准储备液为阳性对照。

72 hpf 时将每孔内已孵化出的幼鱼转移至1.5 mL 离心管中，用标准稀释水清洗2 遍后吸干水分，加入150 µL 5 mg/mL 的脱氧胆酸钠溶液混匀，4℃超声破碎5 min，将破碎后的鱼胚悬液置于超低温离心机中（4℃，10 000 × g）离心5 min，离心后取沉淀，加入1 mol/L 的氢氧化钠溶液150 µL 使沉淀完全溶解，取100 µL 溶解液于96 孔板中，在405 nm波长下测定吸光度，以100 µL 氢氧化钠溶液作为调零对照［12］。

抑制率（%）=［1-（A样-A0）/（A空-A0）］×100

式中，A样为待测样品中孵育出的幼鱼的吸光度，A0为100 µL 氢氧化钠溶液的吸光度，A空为标准稀释水中孵育出的幼鱼的吸光度。

2.5.3 酪氨酸酶活性抑制检测

黑色素生成抑制检测试验中，吸取离心后的上清液100 µL 于离心管中，加入100 µL 5 mM/L 的左旋多巴溶液，混匀，置于37℃恒温培养箱中孵育1 h，取出后吸取100 µL 于96 孔板中，在475 nm 波长下测定吸光度，以100 µL 脱氧胆酸钠和左旋多巴溶液作为调零对照。

抑制率（%）=［1-（A样-A0）/（A空-A0）］×100

式中，A样为待测样品中孵育出的幼鱼的吸光度，A0为调零对照的吸光度，A空为标准稀释水中孵育出的幼鱼的吸光度。

3 结果与分析

3.1 洋葱粗多糖得率与纯度测定

称取150 g 干洋葱进行水提醇沉后共得到洋葱粗多糖11.2 g，由此可以计算出洋葱粗多糖的得率为7.47%。采用硫酸-苯酚法绘制的葡萄糖标准曲线，以葡萄糖浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标得到回归线性方程A= 5.644 6C+ 0.019 6，R2=0.993 2，结果表明葡萄糖在0.05 ~ 0.1 mg/mL 浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。将实验所测得的样品溶液吸光度代入标准曲线中得洋葱粗多糖的纯度为42.11%。

3.2 洋葱粗多糖抗氧化能力测定

3.2.1 羟基自由基的清除率测定

如图1 所示，在2 ~ 10 mg/mL 的浓度范围内，洋葱粗多糖的羟基自由基清除能力随着浓度的升高而增强，当浓度达到10 mg/mL 后，其清除能力未见显著增强的趋势，洋葱粗多糖的最高羟基自由基清除能力为80%左右。图2 中1.0 mg/mL 的维生素C清除自由基的能力与10 mg/mL 的洋葱粗多糖相当，当维生素C 浓度为1.5 mg/mL 时，其自由基清除率接近100%，因此可以说明洋葱粗多糖的羟基自由基清除能力虽不及维生素C，但浓度为10 mg/mL以上的洋葱粗多糖仍具有较好的羟基自由基清除能力。

图1 洋葱粗多糖羟基自由基清除能力Fig.1 Hydroxyl radical scavenging ability of onion crude polysaccharide

图2 维生素C羟基自由基清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of Vitamin C

3.2.2 超氧阴离子自由基的清除率测定

如图3 所示，虽在2 ~ 20 mg/mL 的浓度范围内，洋葱粗多糖的超氧阴离子自由基清除能力随浓度的升高而提升，但20 mg/mL 时最高清除率只达25.29%，与此相比，图4 中所示的维生素C 在浓度为0.2 mg/mL 时超氧阴离子自由基清除率已达到了94.89%，由此可以说明洋葱粗多糖对超氧阴离子自由基清除效果不显著，远低于维生素C 在低浓度下达到的高清除率。

图3 洋葱粗多糖超氧阴离子自由基清除能力Fig.3 Superoxide anion radical scavenging ability of onion crude polysaccharide

图4 维生素C超氧阴离子自由基清除能力Fig.4 Superoxide anion radical scavenging ability of Vitamin C

3.3 洋葱粗多糖美白功效测定

3.3.1 美白功效定性分析

如图5所示，与空白对照相比，洋葱多糖浓度为0.1 ~ 0.2 mg/mL 时幼鱼眼部黑色素沉积无明显变化，背脊两侧和背脊部黑色素略有减少；洋葱多糖浓度为0.3 mg/mL 时，幼鱼眼部、背脊两侧和背脊部黑色素沉积减少较为明显；洋葱多糖浓度为0.4 ~0.5 mg/mL 时，黑色素沉积明显减少且与0.5 mg/mL的熊果苷阳性对照无明显差异。

图5 不同浓度洋葱粗多糖对斑马鱼胚胎黑色素沉着的影响Fig.5 Effect of different concentrations of onion crude polysaccharides on melanin deposition in zebrafish embryos

3.3.2 黑色素生成抑制检测

如图6 所示，在0.1 ~ 0.5 mg/mL 浓度范围内，洋制率仅为49.38%，由此可以说明，洋葱粗多糖在0.4 mg/mL 以上浓度时对酪氨酸酶活性抑制能力较为显著，浓度在0.4 mg/mL 以下时对酪氨酸酶活性抑制能力未表现出较好水平。

图6 黑色素生成抑制效果Fig.6 Inhibition effect of melanin generation

4 讨论

葱粗多糖的黑色素生成抑制能力随浓度的升高而增强，0.5 mg/mL 时抑制率达最高值95.58%，且此浓度下洋葱粗多糖的黑色素生成抑制能力与同一浓度下的熊果苷相当，由此可以说明，0.5 mg/mL 的洋葱粗多糖具有很好的抑制黑色素生成的能力，0.4 mg/mL 的洋葱粗多糖的黑色素生成抑制能力也较为显著。

3.3.3 酪氨酸酶活性抑制检测

如图7 所示，在0.1 ~ 0.5 mg/mL 浓度范围内，洋葱粗多糖的酪氨酸酶活性抑制能力随浓度的升高而增强，0.5 mg/mL 时抑制率达最高值75.72%，与同一浓度下熊果苷的抑制能力相当；浓度为0.1 ~0.4 mg/mL时，洋葱粗多糖的酪氨酸酶活性抑制能力处于相对偏低的水平，浓度为0.4 mg/mL 时的抑

图7 酪氨酸酶活性抑制效果Fig.7 Inhibition effect of tyrosinase activity

我国洋葱生产分布广泛、产量巨大，为世界主要的洋葱生产国［13］。国内外学者的相关实验表明，洋葱中可分离纯化出类黄酮、多酚、含硫化合物、多糖等多种不同的化学物质，具有免疫调节、抗氧化、降血糖、降血脂、抑菌等生物学活性特性［2］，在食品、保健食品、化妆品等领域具有广泛的开发利用价值。目前，国内针对洋葱的工业化加工生产仍局限在脱水干燥等初加工阶段，洋葱的重要功效未得到充分利用，洋葱产品的附加值水平偏低，我国学者在对洋葱中生物活性成分的药理作用进行研究的同时，也可推动学术研究与产业化应用的结合，进一步挖掘生产以洋葱为原料的健康产品和化妆品［14］。

Zhao 等研究表明，采用不同提取方法得到的洋葱中的化合物会对机体的健康功能产生不同的影响［15］。本实验采用水提醇沉法制得洋葱粗多糖，并测定了其多糖纯度，同时对洋葱粗多糖的抗氧化和美白功效进行了初步研究。实验结果表明，本论文制备得到的洋葱粗多糖得率为7.47%，多糖纯度为42.11%。进一步对洋葱粗多糖的抗氧化和美白功效进行研究，结果显示，洋葱粗多糖具有较好的羟基自由基清除能力，当洋葱粗多糖浓度达10 mg/mL时，羟基自由基清除率接近甚至超过80%，虽清除效果不及维生素C，但可为以洋葱为主要原料的抗氧化剂的开发提供一定的理论基础和产品开发新思路。洋葱粗多糖的超氧阴离子自由基清除能力效果不显著，可能是由于粗多糖溶液中含有的糖、蛋白质等生物大分子作为超氧阴离子自由基的攻击对象而出现交联断裂、空间结构遭到破坏的现象，从而丧失了其本身具有的生物学活性。在利用斑马鱼胚进行洋葱粗多糖美白功效评价的研究中表明，0.4 mg/mL 和0.5 mg/mL 的洋葱粗多糖溶液具有较好的抑制黑色素生成和酪氨酸酶活性的作用，尤其是0.5 mg/mL 的洋葱粗多糖溶液黑色素生成抑制率为95.58%，酪氨酸酶活性抑制率为75.72%，与阳性对照0.5 mg/mL 的熊果苷溶液美白活性相当。由此可以说明，洋葱粗多糖可能是一种与熊果苷活性相当的天然美白剂。

5 展望

本实验采用水提醇沉法提取洋葱中的粗多糖，为提高多糖的提取率，可进一步筛选耐高温的复合酶结合热水提法进行洋葱多糖的提取。为提高洋葱多糖的纯度并增强其生物活性，可经过脱蛋白、脱色素、透析去离子等纯化工艺后进一步研究其生物活性的改变。洋葱多糖的美白功效尚未被充分挖掘，后续可进一步对洋葱多糖美白功效的作用机制进行深入研究，揭示其发挥美白功效的作用通路、相关基因和蛋白等信息，获得天然、安全、高效的植物源性美白成分。