中华猕猴桃花药组织培养及植株再生

刘 磊，李 薇，李争艳，雷 华，宋正江，苏彩晴，高本旺

（三峡植物园管理处，湖北 宜昌 443000）

猕猴桃隶属于猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia），包含54 个种和21 个变种，共约75 个分类单元［1］。我国蕴含着丰富的猕猴桃野生资源，除尼泊尔猕猴桃（A. strigosaHook. f. & Thomson，尼泊尔）和白背叶猕猴桃（A. hypoleucaNakai，日本）为周边国家特有分布外，其余猕猴桃在我国均有分布。猕猴桃作为一种重要的经济果树，其栽培驯化史仅100 余年，其中中华猕猴桃和美味猕猴桃被广泛种植。依托丰富的野生种质资源，我国科研人员开展直接选优、实生选种、杂交育种、化学诱变，直至现在的分子标记辅助、转基因和基因编辑定向育种等多种育种技术，在果实颜色上逐渐形成了猕猴桃市场的绿肉、黄肉、红肉以及即食型软枣猕猴桃的多样化格局［2］。

猕猴桃为多年生、功能性雌雄异株植物［3］，该属植物具有重叠分布区域，并普遍存在天然杂交和基因渐渗现象［4］。在自然状态下，猕猴桃属植物有二倍体、四倍体、六倍体和八倍体及少量的三倍体、五倍体和非整倍体等多种倍性，且在种间及种内呈网状分布格局［5］。自然界频繁的种间杂交和种内连续的倍性变异，意味着在猕猴桃属植物分布区内存在自然杂交带，形成网状进化格局［6］。因此，像猕猴桃这样雌雄异株、遗传背景复杂的植物，杂交育种耗时费力，育种周期长，很难获得纯合系。而基于野生资源直接选育栽培品种具有很大的盲目性和偶然性。

单倍体和双单倍体技术的应用，可以显著缩短育种周期，一步获得100%纯合系。同时，因单倍体植株遗传背景单一，便于基因组测序拼接和基因功能验证。单倍体可以自然发生，但频率很低，需要人工诱导来满足植物育种的需求。通过发育不成熟的子房、花药或者分离小孢子体外培养的方法可以获得单倍体或双单倍体再生植株［7-8］。研究人员通过未受精的子房培养获得补骨脂（Psoralea corylifolia）［9］、三花龙胆（Gentiana triflora）［10］等植物的单倍体和双单倍体植株，通过离体小孢子培养获得苜蓿（Medicago sativaL.）［11］、硬质小麦（Triticum turgi-dumL.）［12］单倍体和双单倍体植株。花药培养获得单倍体植株是一种常用的方法，在非洲堇属（Saintpaulia）［13］、麻风树（Jatropha curcasL.）［14］、红掌（Anthurium andraeanum）［15］等植物中均有应用。

目前猕猴桃花药培养报道较少。最早始于20世纪80 年代，只获得体细胞胚，没有实现小孢子胚胎发生［16-17］。2018年在软枣猕猴桃花药培养中才真正意义上成功获得单倍体植株［18］，但基于中华猕猴桃和美味猕猴桃花药培养获得单倍体或双单倍体植株的研究尚未报道。本文以二倍体中华猕猴桃栽培品种‘桂海4 号’雄株花药为实验材料，拟通过处于单核期花药培养获得猕猴桃单倍体或双单倍体再生植株。

1 材料与方法

1.1 材料

以三峡植物园管理处猕猴桃种质资源圃内中华猕猴桃授粉品种‘桂海4 号’花药为实验材料，根据花蕾形态与花粉发育时期关系［19］，采集小孢子发育处于单核期、健壮、无病虫害花蕾，于4℃冰箱黑暗冷藏5天。

1.2 外植体处理及消毒

将花蕾依次用自来水冲洗30 min，75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3 次 ，0.1% HgCl2浸泡7 min，无菌水冲洗3次，备用。

1.3 愈伤组织诱导

在无菌条件下，去除花萼及花瓣，取出完整花药，接种至愈伤组织诱导培养基上。诱导愈伤组织的基本培养基为MS 培养基，添加2，4-D（浓度为0 mg/L，1 mg/L，2 mg/L）、5 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、6 g/L 琼脂以及0.1 g/L PVP（聚乙烯吡咯烷酮），PH 5.8。每瓶接种约30 个花药，每个处理接种2瓶，重复3次。置于25 ± 2℃的培养室，黑暗条件下培养15 天，后在光照强度2 000 ~ 3 000 Lx、光周期为16 h 光照/8 h 黑暗条件下培养。接种30 天后，统计愈伤组织诱导率。诱导率 = （诱导出愈伤组织的花药/各处理接种的花药总数） × 100%。

1.4 体细胞胚诱导、继代及植株再生

将愈伤组织转接到体细胞胚诱导培养基上，体细胞胚诱导培养基添加0.05 mg/L NAA，或0.05 mg/L 2，4-D，或不同浓度的IBA 和6-BA，或同愈伤组织诱导培养基。将诱导出的体细胞胚转接至上述培养基进行继代培养，统计体细胞胚增殖率，即（增殖的体细胞胚数/接种的体细胞胚总数）× 100%。挑选发育成熟的体细胞胚转接至再生培养基进行体细胞胚萌发，植株再生培养基为培养条件为光强2 000 ~ 3 000 Lx，光周期为16 h光照/8 h黑暗，4~5 周后，统计成苗数量，计算再生率 = （丛生芽数量/接入胚体数量） × 100%。

1.5 生根培养

待幼苗长出2~3片真叶，苗高2~3 cm，转至生根培养基，生根培养基见表4，培养条件同植株再生培养时。

1.6 倍性检测

取再生植株幼嫩叶片，以‘桂海4号’雄株的幼嫩叶片为对照，由中国科学院武汉水生生物研究所利用Gytoflexs 流式细胞仪（Beckman，美国）进行倍性测定。

1.7 数据分析

采用Microsoft Excel 2010 软件统计数据，实验结果均以平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 2，4-D浓度对花药愈伤组织诱导的影响

将花药均匀接种在诱导培养基上（表1），花药在M2 和M3 号培养基上逐渐由黄色变为褐色，花药开始膨大，接种30 天后，可以观察到愈伤组织从花药一端或开裂的花药中长出。需要注意的是要保持花药的完整性，带有花丝的花药极易由花丝形成愈伤组织，破损花药极易由花药壁形成愈伤组织。而M1 号培养基上的花药随着接种时间的推移，花药褐化枯萎不能形成愈伤组织，说明2，4-D 在中华猕猴桃花药培养中具有促进愈伤组织诱导的作用。当2，4-D浓度为1 mg/L时诱导率为58.48%，当2，4-D浓度为2 mg/L 时诱导率为51.50%，但两个处理之间差异不显著，愈伤组织均为淡黄色、结构致密（图1 A）。

图1 中华猕猴桃花药培养获得再生植株过程Fig.1 Anther culture and plantlet regeneration of A. chinensis

表1 2，4-D浓度对花药愈伤组织诱导的影响Tab.1 Effects of 2，4-D concentrations on anther callus induction

2.2 体细胞胚诱导、继代培养及植株再生

将上述愈伤组织转接至表2 中1~14 号培养基培养60 天。观察发现添加2，4-D 的2 号和7~10 号培养基中的愈伤组织均为非胚性愈伤组织，为白色松散状，而其它编号培养基均可产生体细胞胚，可见绿色或黄绿色新生组织（图1 B），在解剖镜下可观察到球形胚、心形胚、鱼雷胚（图1 D-F），说明2，4-D 不利于体细胞胚诱导。体细胞胚继代至1 号、3~6 号和11~14 号培养基上，约20 天肉眼可观察到绿色或黄绿色增殖。35 天后统计体细胞胚的增殖情况，其中1 号、3 号和6 号培养基中的体细胞胚均褐化，4 号、11 号和14 号培养基中的体细胞胚褐化较多或部分褐化，且有分化现象，5 号、12 号和13 号培养基中的体细胞胚褐化较少或部分褐化、无分化现象且增殖率较高，增殖率分别为46.70%、53.30%和46.70%。总体看，12号培养基作为体细胞胚继代培养基效果最佳。

表2 体细胞胚的诱导及增殖Tab.2 Induction and proliferation of somatic embryos

将上述体细胞胚转接至植株再生培养基（表3），20天后观察到除D11号培养基外，其它培养基均可观察到已分化的绿色芽点或丛生芽（图1 C）。35 天后统计再生率，再生率的范围为6.7%~40.0%，D10 号培养基的再生率最低，为6.7%，D7 号培养基的再生率最高，为40.0%。

表3 不同激素组合对植株再生的影响Tab.3 Effects of different hormone combinations on plant regeneration

表4 IBA浓度对生根的影响Tab.4 Effects of IBA concentrations on rooting

2.3 生根培养

待再生植株长出2~3 片真叶，苗高2~3 cm，，转接至R1~R3 生根培养基中进行生根培养。观察发现添加0.5 mg/L IBA 的R2 培养基的生根效果最佳，生根数量多且粗壮，R1 和R3 生根培养基生根情况较差，根的数量少且细弱，并且R3 培养基中再生植株的易形成愈伤组织（图1 G-I）。

2.4 倍性检测

通过中华猕猴桃花药培养获得再生植株51株，以供体‘桂海4 号’雄株为对照，利用流式细胞仪测定其倍性。‘桂海4 号’的均值为14 687.6，根据待测样本均值与对照样均值的比值判断再生植株的倍性，若比值约等于0.5 则为单倍体，若比值约等于1则为二倍体，若比值约等于1.5 则为三倍体，若比值约等于2则为四倍体，以此类推。结果显示，参试的51 株再生植株中有单倍体2 株，占比3.92%，双倍体32株，占比62.75%，三倍体10株，占比19.61%，四倍体6 株，占比11.76%，五倍体1 株，占比1.96%，如图2。

图2 再生植株倍性鉴定Fig.2 Identification of ploidy of regenerated plants

3 讨论

单倍体和双单倍体技术可以一步获得100%纯合系，有效缩短育种周期，花药培养获得单倍体植株是一种常用的方法。

在植物花药培养中，植物生长素种类及浓度将决定小孢子发育途径，如2，4-D 可以诱导愈伤组织发生，而IAA和NAA可以促进胚胎直接发生［20-21］，并且2，4-D在花药培养中的作用具有阶段性。本研究在获得愈伤组织过程中2，4-D 起着重要促进作用，而在由愈伤组织诱导体细胞胚中则不利于体细胞胚的产生。李艳敏等［22］在芍药花药培养中同样经过愈伤组织诱导体细胞胚的途径进行植株再生，仅在愈伤组织诱导阶段添加不同浓度2，4-D，在体细胞胚诱导和成苗培养基中均未添加。2，4-D在软枣猕猴桃花药培养中同样发挥重要作用，添加2，4-D的愈伤组织诱导率基本在50%以上，明显高于其它激素组合［18］，本文中添加2，4-D 的愈伤组织诱导率也达到50%以上，未添加的则不能形成愈伤组织。此外，在实验中发现花药丝或破损的花药壁更容易诱导产生体细胞愈伤组织，Reinert［23］同样认为在花药培养中要保证花药的完整性，否则会刺激花药壁形成体细胞愈伤组织。

体细胞胚胎的发育过程与合子胚的发育过程相似，均有球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚和成熟胚历程。本研究中愈伤组织经诱导产生胚性愈伤组织，在体视镜下能够观察到球形胚、心形胚和鱼雷胚，其后在不同的分化培养基中的分化率为6.7%~40.0%，添加0.05 mg/L IBA 和3 mg/L ZT 的分化率最佳，为40.0%。王广富等［18］在软枣猕猴桃花药愈伤组织培养中，添0.1 mg/L IBA 和3 mg/L ZT 的分化率最佳，为64.55%。此外，本文发现在胚性愈伤组织继代过程中存在分化能力下降现象。肖望等［24］研究发现随着继代时间的延长，贡蕉胚性悬浮细胞的体胚能力下降， 含有正常二倍体染色体数目的细胞数目减少，二者具有一定的相关性，但需要进一步的实验证实。许智宏［25］认为长期继代培养的愈伤组织分化能力下降以致丧失，其原因可能与继代培养中形成大量多倍体及非整倍体细胞有关。本文中继代胚性愈伤组织的分化能力与继代时间的关系以及分化能力下降程度未做深入研究，今后将开展这方面的工作。

花药离体培养属于器官培养范畴，花药除了包含小孢子外还含有体细胞组织（ 花药壁、药隔、花丝） ，如何有效抑制体细胞的生长而不影响小孢子的雄核发育是得到林木单倍体植株的关键［26］。此外，单倍体愈伤组织在植株再生过程中染色体自发加倍，从而发育成双单倍体植株，因此经花药培养获得植株存在倍性混乱、多倍体来源不明等问题［26］。所以花药培养中获得的并非只是单倍体和双单倍体，还包括非单倍体，如二倍体、三倍体、四倍体、五倍体、六倍体［27-28］，再生植株倍性鉴定显得尤为重要。目前常用花药培养再生植株倍性鉴定的方法有：一是组织细胞学观察方法；二是流式细胞仪检测法，进一步确定双倍体再生植株的纯合性则采用分子标记技术。Neeta 等［14］结合流式细胞仪和SSR 分子标记技术检测麻风树（Jatropha curcasL.）花药培养再生植株的倍性和纯合性。李艳敏等［22］在芍药花药培养再生植株倍性鉴定中采用根尖细胞染色体观察法。本研究采用了流式细胞仪检测的方法鉴定中华猕猴桃花药培养再生植株倍性，参试的51 株再生植株中有单倍体2 株，占比3.92%，双倍体32 株，占比62.75%，三倍体10 株，占比19.61%，四倍体6株，占比11.76%，五倍体1株，占比1.96%。对与本文中的双倍体再生植株的纯合性需要进一步采用分子标记进行验证，以区分双单倍体。

长期以来猕猴桃的优良品种选育多以传统方法为主，单倍体育种方面的工作开展较少。猕猴桃花药培养只获得体细胞胚，没有实现小孢子胚胎发生［16-17］。Chalak 和Legave 对美味猕猴桃栽培品种‘海沃德’（六倍体）的花粉进行辐射，成功诱导三倍体再生植株［29］。Pandey 等［30］用辐射的猕猴桃花粉进行授粉，诱导孤雌生殖。2018 年基于软枣猕猴桃花药培养成功获得单倍体再生植株［11］，其单倍体植株诱导率为3.36%，与本研究中的单倍体植株诱导率3.92%相当。总的来说，猕猴桃属植物中单倍体和双单倍技术应用较少。本研究初步建立花药——愈伤组织——体细胞胚——植株再生的培养体系，可为中华猕猴桃或其它猕猴桃种的花药培养获得再生植株提供借鉴，再生单倍体或双单倍体植株是猕猴桃的新种质，可为猕猴桃育种提供重要育种材料。此外，猕猴桃属植物倍性复杂，不利于该属植物基因组测序和基因功能验证工作的开展。单倍体和双单倍植株的获得，简化了全基因组测序的拼接工作，并且单一的遗传背景便于基因功能的验证。