植物水杨酸受体NPR结构与功能研究进展

杨文博，严汉池

（天津大学 生命科学学院，天津 300072）

水杨酸（Salicylic acid， SA）是一种β 羟基酚酸，广泛存在于植物中。20 世纪90 年代，SA 作为主要植物激素进入人们的视野［1］。NPR 家族蛋白为SA受体，在细胞核内作为关键共转录因子参与SA介导的植物生理过程。植物NPR1基因首次由Dong等人发现并克隆获得［2-3］。正常植物中的NPR1基因为组成型表达，在蛋白水平上受SA 调控［4］。NPR1 以寡聚体形式存在于细胞质中，当植物细胞内SA浓度水平上升，寡聚体NPR1 发生解聚并进入到细胞核中发挥生物学功能［2-3］。随着植物NPR 研究的不断深入，NPR 结构及生理功能已被揭示。本文就NPR 在植物SAR、形态发育、冷胁迫、昼夜节律中生物学功能发挥及NPR1、NPR1-TGA3、NPR4 空间结构的最新研究进展进行归纳总结，为阐明植物NPR 复杂分子作用机制奠定基础，为解决植物育种及胁迫条件下培养问题提供新思路。

1 NPR生物信息学分析

植物NPR 蛋白包含3 个结构域，分别为BTB/POZ 结构域、ANK repeat 结构域和SBD［5-6］。拟南芥中共存在6 种NPR 蛋白，分别为AtNPR1（At为拟南芥）、AtNPR2、AtNPR3、AtNPR4、AtNPR5、AtNPR6［7］。NPR 同源序列比对结果显示（见表1），AtNPR1、AtNPR2、AtNPR3 和AtNPR4 各结构域较为保守，AtNPR5和AtNPR6 的SBD 保守性较低。AtNPR5/AtNPR6-SBD 低保守性是由于NPR 在进化过程中，不同成员间功能差异性所造成的［8］。在不同农作物中，NPR1各结构域保守性较高（见表1），这与NPR1在农作物体内感知SA 及生物学功能发挥密切相关。对比拟南芥NPR与不同农作物NPR1保守性（见表1），两者的BTB/POZ 结构域及ANK repeat 结构域保守性较高。BTB/POZ结构域和ANK repeat结构域的高保守性对于维系NPR 空间结构稳定、寡聚体形成和生物学功能发挥起着至关重要的作用。

表1 NPR全长及各结构域保守性分析Tab.1 Conservative analysis of NPR full length and each domain

2 NPR生物学功能

2.1 NPR调控植物SAR反应

在自然界中，植物不断面临各种病原微生物的入侵。病原微生物不仅会导致植物各类疾病，还会使农作物产量降低10%~40%［4］。为了高效抵御病原微生物感染，植物进化出了一套复杂的先天免疫防御系统。植物先天免疫防御系统包含PTI 与ETI［9-10］。植物开启PTI与ETI反应后，会激活抵抗继发性感染的防御机制，即SAR。SAR 是植物产生的广谱抗性反应，使植物在受到后续病原体攻击时能够更快、更强烈、更有效地激活防御反应［11］。NPR1通过激活病程调控（Pathogenesis related， PR）基因的表达，对SA介导的SAR反应产生调控作用［12］。

Weigel等人通过酵母双杂交实验在拟南芥中发现了能够与NPR1 发生相互作用的抑制性蛋白NIMIN1、NIMIN2 和NIMIN3［13］。NIMIN 蛋白是NPR1阻遏物，在SA 介导的SAR 反应中抑制PR基因表达［14］。当SA 浓度处于较低水平时，细胞核内NIMIN3 与NPR1 结合，抑制下游PR基因表达。随着SA 浓度的逐渐提高，NIMIN2 替代NIMIN3 与NPR1的C 末端结合，激活早期SA 以及NPR1 依赖性基因NIMIN1的表达。NIMIN1被表达后，取代NIMIN2与NPR1 发生作用。NIMIN1 对NPR1 的作用是短暂的，NIMIN1 不稳定性将促进NPR1 对PR基因的激活（见图1 A）［15］。

图1 NPR调控植物SARFig.1 The NPR regulating SAR in plants

NPR1 不具备DNA 结合结构域，不能直接与PR基因启动子结合。酵母双杂交结果显示，NPR1 在细胞核内与部分TGA 家族成员形成NPR1-TGA 激活态复合物，促进PR基因的激活表达［16-18］。TGA 是一类具有亮氨酸拉链结构的转录因子，能够与包括拟南芥PR基因启动子在内的类as-1样启动子元件结合［19-20］。TGA 转录因子家族存在4 类亚家族，分别为Ⅰ类，TGA1 和TGA4；Ⅱ类，TGA2、TGA5 和TGA6；Ⅲ类，TGA3 和TGA7；IV 类，TGA9 和TGA10［21-22］。当植物受到病原微生物感染时，细胞核内活性NPR1 与TGA2、TGA3、TGA5 和TGA6 结合，增强TGA2、TGA3、TGA5 和TGA6 对PR基因启动子的结合能力，促进PR基因的表达，使植物建立SAR反应（见图1A）［23］。

在部分NPR1-TGA 复合物中，研究人员发现了CBP/p300（CREB binding protein/p300）家族组蛋白乙酰转移酶（Histone acetyltransferase，HAT）组分［24］。拟南芥中存在具有HAT 活性的HAC（CBP/p300-like protein），HAC 通过形成HAC-NPR1-TGA 复合物，在PR基因启动子上发挥组蛋白乙酰化依赖性染色质重编程作用，使PR基因染色质松散，激活PR基因表达，促进植物建立SAR 反应（见图1 A）［24-25］。HAC 通过NPR1 与TGA 间的相互作用被招募到PR基因染色质，推测HAC 是NPR1 与TGA 在染色质环境中有效结合所必需的［24］。

为了防止SAR 反应的过度激活、保证细胞正常存活，植物通过NPR3/NPR4 以及HOS15（High expression of osmotically responsive genes 15）途径抑制SAR 反应（见图1 A）［26-27］。高浓度SA 条件下，细胞核内NPR3/NPR4 与Cullin3 形成降解复合物，介导NPR1 的降解，抑制SAR 反应［27］。HOS15 为细胞核内转录抑制因子，能够与ASKs（Recombinant apoptosis signal regulation kinase）、Cullin1 和Cullin4-RING E3 泛素连接酶形成SCFHOS15E3 泛素连接酶复合物，抑制SAR反应［26］。

Dong 等人认为，NPR3/NPR4 与NPR1 存在相互作用，能够介导NPR1 降解［16，27］。但哥伦比亚大学Zhang 等人通过酵母双杂交、蛋白质免疫共沉淀方法均未发现NPR3/NPR4 与NPR1 之间存在相互作用，也未检测到NPR3/NPR4 与Cullin3 之间的相互作用［28］。Zhang 等人认为，NPR3/NPR4 在抑制SAR反应中独立于NPR1 发挥功能（见图1 B）［28］。低浓度SA 条件下，NPR3/NPR4 与TGA 转录因子结合，抑制SAR 反应［28］。由于两种结论的存在，NPR3/NPR4是否独立于NPR1 发挥作用以及发挥作用的分子机制还需进一步探讨。

2.2 NPR抑制植物幼苗顶端钩的形成

植物幼苗在生长发育过程中会形成顶端钩，顶端钩为幼苗冲破土壤提供动力，保护分生组织免受机械损伤。乙烯（Ethylene，ET）调控因子EIN3/EIL1（Ethylene insensitive 3/EIN3-like 1）通过N 端DNA结合结构域与下游钩形成基因HLS1（Hookless 1）启动子作用，促进幼苗顶端钩形成［29-31］。研究发现，在高浓度SA 条件下，细胞核内单体NPR1能够与EIN3的DNA 结合结构域发生相互作用，干扰EIN3 与靶基因（包括HLS1）启动子的结合，抑制植物幼苗顶端钩的形成（见图2A）［29］。

图2 NPR其他生理功能Fig.2 Other physiological functions of plant NPR

2.3 NPR促进植物叶片衰老

叶片衰老有助于植物形态发育以及大量营养再利用。遗传分析结果表明，NPR1、WRKY46 以WRKY6功能依赖性方式协同调控SA介导的植物叶片衰老过程［32-35］。当植物细胞内SA 水平上升时，细胞核内活性NPR1 激活WRKY46基因的表达，并与WRKY46 作用形成NPR1-WRKY46 复合物。NPR1-WRKY46 复合物识别WRKY6启动子W-box序列（TGACCA/T），诱导WRKY6表达。WRKY6靶向叶片衰老基因，促进植物叶片衰老（见图2B）［33］。

2.4 NPR促进植物抵抗冷胁迫

低温是影响植物生长发育的主要非生物胁迫。低温决定了植物的地理分布，影响了植物的生长发育及产力［36-37］。为了应对外界冷胁迫，植物进化出了受NPR1 调控的冷适应过程。当植物受到冷胁迫时，细胞质中寡聚体NPR1 通过TRXH3/TRXH5-SnRK2.8 依赖性途径以单体形式转移到细胞核［38］。单体NPR1 与热休克反应调节因子（Heat shock transcription factor 1， HSFA1）相互作用，诱导热休克反应蛋白的大量表达（见图2C）［36，39］。热休克反应蛋白的表达将最大限度地减少低温对植物体的影响，使植物适应外界寒冷［40］。

2.5 NPR调节植物昼夜节律

大多数植物都具有某种特定的生物钟，生物钟控制植物光/暗循环下的离子稳态、激素信号传导、糖感应、光周期开花和压力信号传导等多种生理过程［18］。生物钟能够驱动内源性昼夜节律变化，使植物在连续光照或黑暗条件下也可以遵守大约24 小时的周期［41］。有证据表明，受细胞内SA节律性积累变化影响，NPR1 作为氧化还原感受器参与晨钟基因LHY（Late elongated hypocotyl）以及晚钟基因TOC1（Timing of CAB expression 1）的表达，对植物昼夜节律进行调控（见图2D）［42-44］。植物晚钟基因TOC1表达水平在夜晚达到峰值，NPR1 的诱导会提高TOC1在夜间的表达水平，延长植物昼夜节律周期［45-46］。晨钟基因LHY的表达在黎明时刻达到峰值，受到NPR1 诱导后，LHY基因表达上调［43］，影响植物昼夜节律周期。

3 NPR空间结构

3.1 NPR139-410空间结构

为了获得NPR1结构信息、阐明NPR1复杂分子作用机制，Kumar 等人通过X-ray 方法，以3.06 Å 的分辨率解析了拟南芥NPR139-410的三维空间结构［6］。NPR139-410为同源二聚体，两个BTB/POZ 结构域以“头对头”的方式相互作用（见图3A）［6，47］。结构显示（见图3 B），NPR1-BTB/POZ 结构域核心是由中心的3 个β 折叠（B1、B2、B3）和外侧的5 个α 螺旋（A1、A2、A3、A4、A5）所组成［6，47］。在BTB/POZ 结构域C末端，存在由4 个螺旋束（A6、A7、A8、A9）所构成的BHB 结构，BTB/POZ 结构域通过BHB 与ANK repeat结构域连接（见图3 B）［6］。NPR1-ANK repeat 结构域由3 个标准的ANK（ANK2、ANK 3、ANK 4）结构以及1 个非标准的ANK（ANK1）结构所组成（见图3 B）。ANK1与ANK2通过环状结构连接，ANK2、ANK3、ANK4 通过β 发夹结构连接［6］。每个ANK 结构连接桥中包含保守的组氨酸残基（如ANK2-H300、ANK3-H334）［48］，这些组氨酸残基在PR基因表达及SAR 反应建立中起到至关重要的作用。在拟南芥nim1-2 突变株以及npr1-1 突变株中，PR基因转录水平下降，SAR反应缺陷［6］。

图3 NPR蛋白空间结构［6，54］Fig.3 NPR proteins spatial structure［6，54］

NPR1-BTB/POZ 结构域中存在由C150X4C155X1H157X2C160所组成的锌指结合基序，能够对Zn2+的结合进行调控［49］。当C150、C155、H157、C160发生突变后，NPR1 结合Zn2+能力显著下降［49］。在锌指结合基序中，D152 能够与ANK4 中的L370 以及Q371 形成氢键，锁定锌指结构与ANK4 的空间构象，促进NPR1与转录因子TGA 的相互作用［6］。当D152 发生突变后，NPR1 无法与TGA 发生相互作用，PR基因的表达及SAR 反应的建立受到严重影响［2，50-51］。锌指结合基序中的C156 作为氧化还原感受器，参与NPR1单体界面处的相互作用［6］。拟南芥C156 突变株中，大部分NPR1以单体形式存在，NPR1丧失与TGA 结合的能力［6］。

Kumar等人所解析的NPR139-410空间结构中不包含NPR1-SBD，但NPR4-SBC（SA binding core）与NPR1-SBD 具有很高的序列同源性，因此研究人员通过分子对接手段将NPR4-SBC 与NPR1-ANK repeat 结构域进行对接［52］。SWISS-MODE 模型显示，NPR1-SBD由4段α螺旋（α1、α2、α3、α4）构成，并与ANK repeat 结构域存在相互作用［6］。NPR1-SBD 中α2 螺旋I450、α3-α4 螺旋连接桥中F507 和F508 与ANK3 和ANK4 的L346、L393、I397 之间形成了一个疏水界面，该疏水界面对于NPR1 与转录因子TGA的结合以及NPR1 的类径素化（Small ubiquitin-like modifier，SUMO）修饰起到至关重要的作用［6，53］。

3.2 NPR1-TGA3复合物空间结构

Kumar 等人通过冷冻电镜方法，以3.6 Å 的分辨率解析了NPR1-TGA3 激活态复合物的三维空间结构［6］。NPR1-TGA3 复合物结构以（TGA3）2-（NPR1）2-（TGA3）2形式存在，二聚体NPR1 作为“桥梁”连接两个与DNA 结合的TGA3 二聚体（见图3 C）［6］。结构显示（见图3 D），TGA3 存在NPR1 结合结构域（NPR1-interacting domain，NID）。NID 由5 个突出的长螺旋（α1、α2、α6、α7、α8）以及3 个短螺旋（α3、α4、α5）组成。4 个长螺旋α1、α2、α6、α7 形成一个拱形层，而3个短螺旋α3、α4、α5以“之”字形穿过该层并支撑α8 螺旋远离拱形层［6］。NID 二聚体由3 个短螺旋α3、α4、α5 之间以及1 个单体中倾斜的α8 螺旋与另1个单体中的α6-α7螺旋之间的广泛相互作用所形成［6］。在TGA-NID 内部存在棕榈酸（见图3 D），暗示脂质代谢在植物免疫调节中可能发挥作用［6］。

结构显示（见图3 E），NPR1 与TGA3-NID 存在精细的调控作用。TGA3-IND 中α5-α6 的P264、T266 和 α7-α8 的T351 形成疏水凹面，NPR1 通过ANK1 的L281、L282 与该凹面产生疏水作用［6］。同时，ANK1中的L272、S276、D277、D278、G280、E288、H290与TGA3中的Q263、D267、T352、R353、R357形成氢键以及盐键参与NPR1与TGA3的结合［6］。

3.3 NPR4-SBC结构

NPR4 同样为SA 受体，在植物细胞中与NPR1发挥拮抗作用。NPR4-C 末端第373 位氨基酸到第516 位氨基酸被鉴定为SBC 区域，NPR4 通过该区域与SA 结合［54］。Wang 等人通过晶体学方法，以2.3 Å的分辨率解析了结合SA后的NPR4-SBC结构［54］。

结合SA 后的NPR4-SBC 在外形上呈“锥”形，由5 个紧密排列的α 螺旋（αN、αSC1、αSC2、αSC3、αSC4）组成（见图3 F）。αSC1、αSC2、αSC3、αSC4 形成疏水SA 结合口袋，侧面αN 螺旋起到稳定该结构的作用。SA 结合口袋的底层由αSC2 的E430 以及αSC4的C499组成，E430、C499被来自αSC1和αSC3的F427 以及F496 所支撑［54］。由于底层的E430 侧链羧基指向溶剂，所以E430、C499、F427、F496 会形成疏水环境，固定SA 的苯环部分［54］。在SA 结合口袋中间层，αSC1 的A423 以及αSC3 的G492 将SA 的苯环夹在中间，αSC2 的A431 和A434、αSC4 的Y500和L503 包围苯环边缘［54］。在SA 结合口袋顶层，αSC1 的V420 和αSC3 的V489 以相互交叉的形式将SA 密封在结合口袋中（见图3 F）［54］。作为SA 结合口袋标志性残基，R419 通过氢键和离子键与SA 的羧基形成相互作用，稳定SA与结合口袋的结合［54］。

4 展望

本文对NPR 家族蛋白在植物SAR、形态发育、冷胁迫、昼夜节律调控过程中所发挥的生物学功能以及NPR1、NPR1-TGA3 复合物、NPR4 空间结构的最新研究进展进行综述。虽然植物NPR 家族蛋白的功能与结构已得到广泛探究，但是仍存在一些问题急需解决。

（1）NPR 家族蛋白调控植物多种生理过程，除NPR1 在SAR 反应中的作用机制已通过NPR1-TGA3 结构得到阐明，NPR 其余作用机制未通过蛋白结构被阐明。

（2）NPR1 作为SA 受体，功能的发挥依赖于SA所诱导的构象变化。由于NPR1-SBD 区域柔性较大，所以NPR1-SBD空间结构至今并未得到解析。

（3）NPR3/NPR4 功能的发挥是否独立于NPR1及NPR1 在细胞核内的降解过程还需要进一步探究。

外界生物及非生物胁迫对农作物生长发育造成不利影响，严重则导致作物产量下降，影响人类身体健康，对我国经济造成巨大损失。作为农业大国，我们一直致力于增强农作物对外界胁迫的抗性，增加作物产量。如今，NPR 家族蛋白在多种农作物中已被鉴定，并且在广谱抗性中发挥重要作用。因此，NPR 家族蛋白结构与功能的研究将为解决植物培育问题提供全新思路。