中药刺五加叶质量标志物预测分析

孙 悦，张楠淇，杜 锐，赵 岩

（吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130000）

刺五加叶为五加科植物刺五加［Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim） Harms］的干燥叶片，具有补益肝肾，益精壮骨之功效，适用于短暂性脑缺血、脑动脉硬化、脑栓塞等，亦可用于冠心病、心绞痛、以及神经衰弱、更年期综合症等。《黑龙江省中药材标准（2001 年版）》记载刺五加叶化学成分包括刺五加苷I，K，L，M 以及金丝桃苷［1］，然而刺五加苷I，K，L，M 在五加属植物中广泛存在。基于一种或多种成分测定的中药质量评价通常不能说明中药物质基础的特异性和专属性。针对上述存在的问题，本研究基于中药质量标志物（Quality marker，Q-marker）理论［2］，对刺五加叶的质量标志物进行预测，为刺五加叶的质量标准制订及质量控制提供依据。

1 基于化学组分和成分转移证据的质量标志物分析

中药的质量要求是传统中医药产业发展过程中的重要组成部分。中药化学成分是发挥其功效的物质基础，能够客观的反映中药质量实质性内容。在中药中存在的有效成分不同于一般化合物，是来自于多组分交互作用的天然产物［3］。因此，刺五加叶质量标志物的筛选应通过化学物质组成及成分传递确定。

1.1 化学物质

目前，国内外学者已从刺五加叶中鉴别出来200 多种化学成分，主要包括有黄酮、三萜、苯丙素、有机酸以及微量元素等［4-23］。刺五加叶含有丰富的黄酮及其苷类，目前已发现该类成分46 种，以黄酮醇苷和黄酮苷为主。三萜类成分是刺五加叶中重要次级代谢产物，以羽扇豆烷型、齐墩果烷型、乌苏烷型和木栓型三萜居多，多以皂苷形式存在于植物体内，目前已发现该类成分125 种。刺五加叶中的苯丙素类化合物包含简单苯丙素类、香豆素、木脂素类化合物，目前已发现该类成分50 种。刺五加叶中还含有有机酸、类固醇、甾体、氨基酸等多种有机化合物及Ca、Mg、Ba、Na 等微量元素。具体信息见表1~3。

表1 刺五加叶中黄酮类化合物Tab.1 Flavonoids in Acanthopanax senticosus leaves

表2 刺五加叶中三萜类化合物Tab.2 Triterpenes in Acanthopanax senticosus leaves

表3 刺五加叶中苯丙素类化合物Tab.3 Phenylpropanoids in Acanthopanax senticosus leaves

1.2 基于血清药物化学证据的质量标志物分析

中药血清药物化学是以实验动物口服给药后的血清为研究对象，借助传统天然药物化学的研究方法和现代技术应用发展起来的，研究血清中的移行成分与中药传统疗效之间的关系，阐明物质在体内的代谢学和动力学［24］，以期为刺五加叶质量标准的建立提供证据。Wang［25］等在对给药刺五加叶的清醒缺血性中风大鼠血浆和海马中与治疗效果相关的活性化合物分析过程中发现金丝桃苷、槲皮素、槲皮苷和咖啡酸可以通过血脑屏障，槲皮素比槲皮苷和金丝桃苷需要更长的摄取时间，但通过率更高。Yamauchi 等［26］在对刺五加叶提取物改善大鼠记忆能力研究中发现，灌胃给药后血液和大脑中移行物质包括刺五加苷M、刺五加皂苷C3、B 和A1，并验证了刺五加苷M、刺五加皂苷C3、B的增强识别记忆活性。通过上述分析，从刺五加叶的原有成分到血中移行成分的系统标识，刺五加叶中金丝桃苷、槲皮素、槲皮苷和咖啡酸，刺五加苷M、刺五加皂苷C3、B 和A1 可以考虑作为刺五加叶候选质量标志物。

2 基于植物亲缘学相关证据的质量标志物分析

刺五加是小型灌木，为五加科五加属植物。在我国五加属植物中能够药用的植物种类较多，应用历史悠久。目前在全球范围内已发现37 种五加属植物（不包括变种），主要分布于亚洲地区。我国的五加属植物资源丰富，广泛分布于长江流域，共有26 种18 变种，其中最常见的是细柱五加、刺五加和红毛五加［27］。五加属植物叶片的主要次生代谢产物为三萜类化合物，且以羽扇豆烷型三萜为主，如chiisanogenin 和chiisanoside 等［28］。将chiisanogenin、chiisanoside 等裂环羽扇豆烷型三萜作为五加科五加属叶类分类依据具有重要植物资源研究意义。

3 基于中药有效性证据的质量标志物分析

中药质量控制的根本目的是确保临床用药过程中的有效性和安全性，同时也是建立质量标志的核心内容。中药药性和药效是中医药理论的核心，反映了中医药在不同层面和方式下对人类疾病所产生的疗效。刺五加叶质量标志物的研究应包括对刺五加叶的药性和药效的认识，以此来反映中药质量的完整性［29］。《本经》［30］中曾提到“入腹则知其性，入口则知其味”，中药的本质与其功效的性质和属性有关，并取决于中药药效的物质基础。因此，将中药药性纳入刺五加叶的质量指标，使中药性质与化学基团密切连接。

刺五加叶味辛、苦，性平，归肝、肾经。“辛”为五味之一，能散、能行、能通、能温、能升、能润、能化，其物质基础多为挥发油、苷类、生物碱和氨基酸成分。目前在刺五加叶中检测到多种挥发性成分，其中以红没药醇、石竹烯以及氧化石竹烯含量最高［31］；刺五加叶中含有多种黄酮苷类成分，主要包括槲皮苷、芦丁、金丝桃苷等，以及少量三萜皂苷刺如五加皂苷A-E、chiisanoside等［32］；而生物碱成分在刺五加叶中少量存在，近年来仅发现两种生物碱类成分Pheophorbide A 和Pyropheophorbide A［33］；此外，在刺五加叶中还检测出多种氨基酸，其中以天冬氨酸和谷氨酸含量较高。中药质量评价的基本目的是患者在服用中药后对机体产生的疗效。因此，刺五加叶质量标志物重要的依据之一是探究刺五加叶的多种药理活性。

3.1 对心脑血管的作用

刺五加叶可用于治疗短暂性脑出血、脑动脉硬化、脑栓塞、冠心病等心脑血管疾病，皂苷类化合物为其主要药效物质基础。有研究发现，刺五加叶皂苷能够减少大鼠心肌缺血-再灌注损伤（Myocardial infarction/reperfusion injury， MI/RI）模型的心肌梗死面积，通过激活ERK1/2 途径减少心肌细胞凋亡；3，4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷chiisanoside、divaroside等能够缓解BaCl2引起的室性心律失常［34-35］。刺五加叶具有神经保护作用，并且对缺血性脑卒中具有一定的疗效。口服刺五加叶能明显降低缺血性脑卒中动物模型的脑含水量和脑指数，缓解血清和脑组织中的神经递质含量异常变化；并能通过减少机体的氧化应激和炎症损伤，在一定程度上治疗缺血性脑卒中［26，36］。刺五加叶能够调节小鼠的认知功能。通过对小鼠进行一系列的学习和记忆测试发现，刺五加叶皂苷能够增强小鼠的记忆能力，通过AGE-RAGE 和PI3K-Akt 信号通路发挥中枢神经保护作用［23，36］。刺五加叶中三萜皂苷元chiisanogenin能够有效抑制血小板聚集，其皂苷提取物能明显改善实验性脑缺血大鼠血液流变学和血小板功能的异常变化［37-38］。

3.2 对机体代谢的调节作用

刺五加叶能够调节机体的代谢功能，刺五加苷E 能够调节与脂质代谢相关的基因表达和代谢物，并且影响脂肪酸合成、β-氧化和脂肪分解过程。刺五加叶可以有效抑制脂肪酶的活性，能促进线粒体脂肪酸氧化和CPT 的活化，减轻高脂饮食引起的小鼠血浆TG水平升高［39-42］。

3.3 镇静催眠作用

刺五加叶提取物能够抑制中枢神经系统，改善小鼠中枢神经兴奋。有研究发现，刺五加叶水提物的镇静催眠活性优于醇提物，刺五加叶乙醇提取物对氯苯丙氨酸（4-Chloro-DL-phenylalanine， p-CPA）诱导的失眠小鼠有明显的拮抗作用，不仅以剂量依赖的方式缩短睡眠潜伏期，而且还增加了小鼠海马体中5-羟色胺（5-Hydroxytryptamine， 5-HT）和 γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid ， GABA）的表达［4，43］。

3.4 抗肿瘤作用

刺五加叶中的皂苷类化合物能抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡。有文献报道，刺五加叶皂苷对小鼠食管癌移植瘤和肾癌细胞具有明显的诱导凋亡及抗增殖作用，其机制可能与凋亡基因bax 蛋白表达增加、bcl-2 蛋白表达下降有关［44-45］。刺五加叶中含有的chiisanoside 对H22 荷瘤小鼠表现出抗癌活性，苷元chiisanogenin 对多种肿瘤细胞株表现出细胞毒活性。

3.5 免疫抗炎作用

刺五加叶具有良好的抗炎效果。研究发现，刺五加叶中提取的水溶性多糖具有显著的免疫生物学活性［46-47］。刺五加叶中分离出的多种皂苷在脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）刺激的骨髓衍生树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells， BMDCs）中表现出显著的抗炎活性，能够显著抑制白细胞介素12（Interleukin-12， IL-12）的产生［46-47］。

3.6 其他

刺五加叶具有抗菌和胃黏膜保护作用。研究发现，刺五加苷K 可通过降低毒力来抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus， MRSA）引起的感染［48］。chiisanoside、chiisanogenin 和金丝桃苷对G（+）和G（-）具有广泛、中度的抗菌活性，最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration， MIC）在50~100 MIC g/ml 范围内［49］。刺五加叶还能保护急性胃黏膜损伤，可明显减轻C48/80 诱导的黏液耗竭和胃黏膜炎症反应，通过抗凋亡机制减少胃黏膜的炎症和氧化应激［50］。

综上，刺五加叶中裂环羽扇豆烷型三萜类化合物chiisanoside、divaroside、chiisanogenin，苯丙素苷类化合物刺五加苷E、K，以及黄酮苷类化合物金丝桃苷等成分可考虑作为刺五加叶的候选质量标志物。

4 基于化学成分可测性的质量标志物分析

中药化学成分的可测性是建立刺五加叶质量评价的基础，同时也是刺五加叶质量标志物筛选的基本原则之一。中药成分复杂不能全部满足与中药相关的专属性要求，只有通过现代技术方法定性或定量要求的化合物才可以被纳入到质量标志物之中。

4.1 定性分析

刺五加叶化学成分的定性分析和鉴别方法主要包括多种色谱、光谱方法及色谱质谱联用技术，常用的方法包括TLC、NMR、MS、HPLC-MS。匡海学课题组［18-20］通过UV、NMR 和MS 等光谱学分析手段从刺五加叶中定性鉴别出包括绿原酸、阿魏酸在内的15 种酚酸类化合物和以芦丁为代表的5 种黄酮类化合物。王知斌等［15］利用NMR和MS光谱学分析方法从刺五加叶中鉴定了包括金丝桃苷、槲皮素在内的9 个黄酮类化合物的结构。李仁杰［51］以chiisanoside 和金丝桃苷为对照品建立了刺五加叶的TLC 鉴别方法。Liu 等［4］使用UPLC-Q/TOF-MS 联用技术从刺五加叶中鉴定出75 种化合物。陈宏昌等［11］采用UPLC-QTOF-MS/MS 法对刺五加叶中的化学成分进行分析，指认出30个化学成分。

4.2 定量分析

针对刺五加叶中活性组分的理化性质，学者们建立了刺五加叶活性组分的定量分析方法。其定量方法以分光光度法、HPLC 法为主，涉及到的活性物质包括总黄酮、总皂苷等有效部位及以chiisanoside 为代表的裂环羽扇豆烷型三萜类、金丝桃苷等黄酮类、绿原酸等苯丙素类有效成分。李仁杰［51］建立了刺五加叶的总黄酮、裂环羽扇豆烷型总三萜皂苷有效部位的紫外-可见分光光度含量测定方法及chiisanoside、chiisanogenin、金丝桃苷、木犀草苷和槲皮素的HPLC 含量测定方法，并阐明了上述有效物质在刺五加叶中的积累规律。修成［52］利用高光谱无损成像技术，建立了刺五加冠层叶片中类黄酮含量的分类和预估方法，实现了避免环境影响和化学检测破坏冠层叶片的快速、实时、准确类黄酮定量分析。关欣等［53］利用一测多评技术建立了适用于刺五加叶中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、槲皮苷等5 种成分含量的同时测定的HPLC方法。

综上，基于化学成分可测性可将以chiisanoside和chiisanogenin 为代表的裂环羽扇豆烷型三萜皂苷类，以金丝桃苷、木犀草苷、槲皮素、槲皮苷为主的黄酮类，以绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸等苯丙素类成分作为刺五加叶的候选质量标志物。

5 结语

刺五加在《神农本草经》中被列为上品，其叶具有补益肝肾，益精壮骨的功效，主要用于治疗心脑方面的疾病，现如今广泛地应用于中药复方和药食同源的保健品，有巨大的市场需求量。产品原料的质量及制剂的生产质量与其临床疗效和安全性直接相关，虽然目前已针对部分刺五加叶中的化学成分建立了定性和定量分析方法，但这些化学成分的选择依据及范围仍欠缺系统性和全面性。采用系统严谨的科学逻辑选定刺五加叶的质量标志物迫在眉睫。本文基于质量标志物的理论指导［54-55］，从刺五加叶原有成分到移行成分的系统标识筛选出3种黄酮类、3种三萜皂苷类成分和2种苯丙素类成分作为候选质量标志物；基于植物亲缘学的相关证据将chiisanoside 和chiisanogenin 为代表的羽扇豆烷型三萜类纳入到刺五加叶的质量标志物行列；再从刺五加叶的传统药性理论和现代药效学依据筛选出3种三萜类、2 种苯丙素类和1 种黄酮类成分；最后通过定性分析和定量分析的角度筛选出刺五加叶中的2 种三萜类、3 种苯丙素类和4 种黄酮类成分。最终确定三萜类成分chiisanoside、chiisanogenin，黄酮类成分金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素，苯丙素类成分刺五加苷E、绿原酸、咖啡酸作为刺五加叶的候选质量标志物。上述质量标志物可作为刺五加叶质量标准的参考，为建立全面系统的刺五加叶质量控制体系，确保临床疗效和用药安全提供依据。