小蓬草地上部分精油的活性组分

刘志明,王海英,刘姗姗,蒋乃翔,马大龙

(1.东北林业大学材料科学与工程学院生物质材料科学与技术教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150040;2.东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040)

芳香植物 (aromatic plants)是含有较多芳香性物质 (精油或树脂状分泌物)的植物,包括全部香料植物、一部分药用植物、一部分园艺植物 (芳香蔬菜、果树和一部分观赏植物)和一些尚没有被开发利用的野生植物,是兼有药用植物和香料植物共有属性的植物类群。小蓬草[ConyzAcanadensis(L.)Cronq.](syn.Erigeron canadensisL.),菊科 (Compositae)白酒草属一年生草本,原产于北美洲,现广泛分布于世界各地。小蓬草具有浓郁芳香气味,是一种芳香植物,嫩茎叶作饲料,全草或鲜叶入药,可以提取精油[1-3]。植物精油可以在医药、食品、精细化工等方面具有广阔应用前景。植物精油除了可以作为食用香料和日用香料赋香之外,还具有杀菌、驱虫、杀虫等功效。近年来,有研究表明植物精油还具有除草作用,Tworkoski的研究结果表明肉桂 (Cinnam om um zeylanicum)精油具有较强的除草活性,而丁香酚 (eugenol)是该精油的主要成分[4]。植物源除草剂是近年来环境友好型除草剂的研究重点,但形成商品的植物源除草剂还比较少,植物源除草剂的开发一般以具有化感作用 (allelopathy)的植物为靶标,研究其具有除草作用的活性成分,直接利用或进行活性成分分子结构修饰、结构改造,开发新型除草剂。化感作用是植物 (包括微生物)释放化学物质到外部环境,影响 (抑制或促进)邻近植物 (异种个体或同种个体)的生长和发育。检测化感物质(allelochemicals)对受体植物种子萌发是化感物质活性研究的一种常见方法,化感物质对种子萌发的影响是植物化感作用研究的重要内容,也是研究热点[5-7]。小蓬草夏秋季易形成单种优势群落,影响其他植物生长,可以利用小蓬草的化感作用开发为环境友好型除草剂,但这方面的研究报道很少,曹慕岚等的研究结果表明小蓬草体内抗旱机制多种多样,能够适应多种生境;小蓬草具有化感作用和生物毒性,其水浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂产生不同程度的抑制和损伤,具有明显的遗传毒性;新鲜小蓬草地上部分和地下部分水浸提液对受体植物水稻和油菜种子最终萌发及根长具有抑制作用[8-10]。Park等[11]研究了韩国小蓬草的挥发性组分。Choi等[12]的研究结果表明韩国小蓬草精油具有细胞毒性。许桂芳等[13]研究了小蓬草新鲜茎叶水浸提液(含有酚类物质)对小麦种子萌发和幼苗生长的抑制作用。高兴祥等[14]研究了小蓬草全株干粉乙酸乙酯和乙醇提取物潜在的除草活性。本文研究通过气相色谱 -质谱 (gas chromatography-mass spectrometry)分析秋季小蓬草地上部分水蒸气蒸馏精油的挥发性组分,选择生长迅速、对药剂反应敏感的常用作测定除草剂活性的小粒种子植物试材油菜,借鉴除草活性初步筛选中适合小粒种子发芽常用的Weiss提出的纸上种子发芽测定标准 (standard seed germination assay on paper)方法 (培养皿法)进行生物测定,寻找新颖除草活性先导化合物,为开发高效、低毒、环境友好型除草剂提供仿生合成模板。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供体植物为小蓬草 (ConyzAcanadensis)地上部分,2008年 9月下旬采自黑龙江省哈尔滨市,东北林业大学城市林业示范基地,并经东北林业大学林学院森林植物资源学植物标本室鉴定。室温下自然风干备用。受体植物的种子为苏州青油菜种子,购自哈尔滨市种子市场。

1.2 试验方法

1.2.1 小蓬草地上部分精油的提取方法

称取 30 g小蓬草地上部分干样,剪成 1～2 cm小段,置于 500 mL三颈烧瓶中,水蒸气蒸馏提取3 h。提取结束后,提取液每次用 50 mL乙醚萃取,共萃取两次,合并乙醚层,加入适量无水 Na2SO4干燥 15 min,过滤后置于 40℃水浴下蒸干乙醚溶剂,得到浅黄色油状精油。再用正己烷 (色谱纯)将精油配制成浓度为 0.04 g/mL的溶液,进行气相色谱-质谱 (GC-MS)分析。

1.2.2 小蓬草地上部分精油的气相色谱 -质谱(GC-MS)分析方法

利用 GC/MS 6890N -5973insert(Agilent,USA),对 0.04 g/mL正己烷精油溶液进行了气质联用分析。分析条件如下:DB-17MS毛细管柱,柱长30 m,内径 0.25 mm,膜厚 0.25μm,F ID检测器;初始温度 60℃,停留 4 min,升温速率 20℃/min,160℃停留 6 min后,再以 5℃/min的升温速率升温到 220℃,保持 2 min。进样口温度 260℃,进样量 1.0μL,分流比 20∶1,氦气载气,流速 1 mL/min;质谱连接口温度:280℃,离子源温度:230℃,轰击电压 70 eV,扫描检测范围:15～260 u。

1.2.3 小蓬草地上部分精油的纸上种子发芽试验方法

借鉴Weiss提出的纸上种子发芽测定标准和国内种子萌发测定方法[14-15],选取籽粒饱满、大小均匀的受体植物油菜种子,置于铺有两层滤纸的已消毒直径为 9 cm培养皿内,每皿各放置 10粒种子,分别加入 1 mL用丙酮 (不溶于水的植物天然产物常用溶剂)配制的 60 mg/mL的小蓬草地上部分精油(对照加 1 mL丙酮)和 9 mL蒸馏水,混合均匀,盖好培养皿盖。放在 HPG-280H人工气候箱内 (25±1)℃黑暗培养,以胚根或胚轴突破种皮 1～2 mm为种子发芽的标准,3次重复,每天观察记录发芽种子的数量,连续统计 7天。

配制 100 mg/mL小蓬草地上部分精油丙酮溶液,然后分别用丙酮稀释成 50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL和 6.25 mg/mL的小蓬草地上部分精油丙酮溶液,按照上述方法进一步研究不同浓度小蓬草地上部分精油丙酮溶液对受体植物油菜种子萌发的抑制作用。

配制 10 mg/mL小蓬草地上部分精油丙酮溶液,然后分别用丙酮稀释成 5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL和 0.625 mg/mL的小蓬草地上部分精油丙酮溶液,按照上述方法进一步研究不同浓度小蓬草地上部分精油丙酮溶液对受体植物油菜种子萌发的抑制作用。

1.2.4 小蓬草地上部分精油的纸上种子发芽试验数据分析方法

根据记录的数据计算下列参数[9,16]:(1)最终发芽率 (Final Germination,FG)FG=发芽种子总数 /供试种子总数;(2)化感效应敏感指数 (Index of Allelopathic Effect,R I)R I=1-C/T(T≥C),R I=T/C-1(T

试验数据用 SPSS16.0软件进行数据处理,对各参数在不同处理之间的差异进行一维方差分析。

2 结果与分析

2.1 小蓬草地上部分精油的气相色谱 -质谱 (GC-MS)结果与分析

小蓬草地上部分精油挥发性组分气相色谱 -质谱 (GC-MS)的总离子流色谱图经计算机质谱库自动检索、解析和部分化合物的人工解析,匹配度 74以上的 10种物质被鉴定,通过面积归一化法计算各化合物的质量分数,小蓬草地上部分精油挥发性组分列于表1。

表1 小蓬草地上部分精油的挥发性组分

从表1可以看出小蓬草地上部分精油挥发性组分中,烃类化合物 4种,醇类化合物 4种,酮类化合物 2种,含氮类化合物 1种,匹配度 74以上的 10种物质被鉴定,小蓬草地上部分精油挥发性组分中,柠檬烯、α-佛手柑油烯、顺式 -β-麝子油烯、α-姜黄烯、反式 -对 -薄荷 -2,8-二烯醇、顺式 -对 -薄荷 -2,8-二烯 -1-醇、香芹醇、反式香芹醇、s-香芹酮在波兰干小蓬草个体发育不同阶段的水蒸馏 (hydrodistillation)5 h全草精油 (herb oil)中被检测到[17],有研究表明,萜类化合物、酚类化合物、直链醇、脂肪族醛和酮等具有化感作用[7,18-20],小蓬草地上部分精油具有开发为植物源除草剂的潜力。

从表1保留时间 16.323 min的质谱人工解析可知,质量差规律的判断依据:最高质量峰与其他碎片离子质量差,如出现以下质量差,4到 13,19到 25(含氟化合物例外),37,38,50到 53,65,66,则最高质量峰不是分子离子峰。另外如差为 14的情况出现,应考虑是否有同系物出现,该质谱中质量数最高的峰是 m/z 174(偶数 ),与 m/z 159(奇数 )相差15 u,为失去合理中性物,因此可以认定 m/z 174为分子离子峰。因其余碎片峰 (m/z)都是奇数,可知该分子离子的碎片峰为分子离子单纯的断裂反应(脱掉中性自由基),根据“氮素原则”,凡不含 N原子或含有偶数个N原子的化合物,分子离子的质荷比应为偶数 (或相对分子质量是偶数)。如果含有偶数个N原子,质谱中出现m/z 77,51,39等弱的碎片离子峰,表明化合物含有苯基;m/z 89表明苯基上有一个含碳的取代基。相对分子质量M=174的分子离子峰,离子失去碎片的情况有:M-43失去的中性碎片为 NHCO,高度分支碳链分支处有环酰胺;M-31失去的中性碎片为 CH2NH2;M-15失去的中性碎片为 CH3,高度分支的碳链,在分支处甲基裂解 (侧链甲基)[21-24],结合计算机质谱库自动检索,初步判定为 2,4-二氢 -2-甲基 -5-苯基 -3氢-吡唑 -3-酮,但有待于进一步分离、提纯、鉴定。

2.2 小蓬草地上部分精油纸上种子发芽试验结果与分析

60 mg/mL的小蓬草地上部分精油对受体植物油菜种子萌发的影响,100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL和 6.25 mg/mL 5个不同浓度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油对受体植物油菜种子萌发的影响,10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL和 0.625 mg/mL 5个不同浓度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油对受体植物油菜种子萌发的影响测试结果均列于表2。

表2 小蓬草地上部分精油对受体植物油菜种子萌发的影响

从表2可以看出,60 mg/mL的小蓬草地上部分精油对受体植物油菜种子萌发具有抑制作用,且与对照相比差异极显著。100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL和 6.25 mg/mL 5个不同浓度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油对受体植物油菜种子萌发均具有抑制作用,且与对照相比差异极显著。10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL和0.625 mg/mL 5个不同浓度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油对受体植物油菜种子萌发均具有抑制作用,且与对照相比差异极显著。小蓬草地上部分精油抑制油菜种子发芽 50%抑制剂浓度 IC50(inhibitor concentration causing 50%inhibition)为0.6 mg/mL。

种子发芽指数是从置床开始算起的,发芽指数高就说明该种子发芽所用的时间短,发芽速度快。从表2可以看出,小蓬草地上部分精油处理的受体植物油菜种子发芽指数均低于对照种子发芽指数,说明小蓬草地上部分精油处理抑制了受体植物油菜种子发芽速度。

综合以上分析,可以看出小蓬草地上部分精油主要是通过抑制受体植物油菜种子发芽速度进而实现抑制其种子萌发,活性组分有柠檬烯、α-佛手柑油烯、顺式 -β-麝子油烯等萜类化合物,反式 -对-薄荷 -2,8-二烯醇、顺式 -对 -薄荷 -2,8-二烯 -1-醇、香芹醇、反式香芹醇等醇类化合物,s-香芹酮等酮类化合物,2,4-二氢 -2-甲基 -5-苯基 -3氢 -吡唑 -3-酮为第一主成分,有望作为除草剂仿生合成模板,需进一步分离、提纯、鉴定。

3 结 论

小蓬草地上部分精油对受体植物油菜种子萌发具有 50%抑制作用的丙酮溶液的适宜浓度 IC50为0.6 mg/mL。小蓬草地上部分精油对受体植物油菜种子萌发具有抑制作用的活性组分匹配度 74以上的有柠檬烯、α-佛手柑油烯、顺式 -β-麝子油烯、反式 -对 -薄荷 -2,8-二烯醇、顺式 -对 -薄荷 -2,8-二烯 -1-醇、香芹醇、反式香芹醇、s-香芹酮等化合物。2,4-二氢 -2-甲基 -5-苯基 -3氢 -吡唑 -3-酮为第一主成分,有望作为除草剂仿生合成模板,需进一步分离、提纯、鉴定。参考文献:

[1] 王羽梅.中国芳香植物 上册[M].北京:科学出版社,2008:401.

[2] 林镕,陈艺林(中国科学院中国植物志编辑委员会).中国植物志[M].北京:科学出版社,1985:348-350.

[3] 聂绍荃,袁晓颖,杨逢建.黑龙江植物资源志[M].哈尔滨:东北林业大学出版社,2003:700-701.

[4] Tworkoski T.Herbicide effects of essential oils[J].Weed Science,2002,50:425-431.

[5] Vyvyan J R.Alleochemicals as leads for new herbicides and agrochemicals[J].Tetrahedron,2002,58:1631-1646.

[6] Anjum T,Bajwa R.Field appraisal of herbicide potential of sunflower leaf extract against Rumex dentatus[J].Field Crops Research,2007,100:139-142.

[7] 杨期和,叶万辉,廖富林,等.植物化感物质对种子萌发的影响[J].生态学杂志,2005,24(12):1459-1465.

食盐，很多初学者对食盐作为面包配方中的基本原料很是不解。食盐可以增加面包的风味；可以强化面筋，保持面团弹力，加强面团的保气能力；控制面团发酵速度，让面团在发酵过程中能均匀膨胀。食盐还可以中和糖的甜味，在含糖量高的面包配方中，可以适当增加食盐的用量。但是过量的食盐不仅能让面包很咸，也会抑制酵母的生长繁殖，因此食盐在面包中的添加量通常为1%～2%（以面粉计）。

[8] 曹慕岚.入侵植物加拿大飞蓬抗旱性及生物毒性的初步研究[D].硕士学位论文,2007.

[9] 曹慕岚,李翔.入侵植物—加拿大飞蓬对作物种子萌发及幼苗生长的影响[J].成都大学学报:自然科学版.2008,27(3):187-190.

[10] 曹慕岚,罗群,张红,等.入侵植物加拿大飞蓬 (Erigeron canadensisL.)生理生态适应初探[J].四川师范大学学报:自然科学版.2007,30(3):387-390.

[11] Park Y H,Choi H J,Wang H Y,et al.Volatile components of Erigeron canadensis L.in Korea[J].Korean Journal of Weed Science,2007,27(3):268-274.

[12] ChoiH J,Wang H Y,Kim YN,et al.Composition and cytotoxicity of essential oil extracted by steam distillation from horse weed(Erigeron canadensis L.)in Korea[J].Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry,2008,51(1):55-59.

[13] 许桂芳,刘明久,晁慧娟.入侵植物小蓬草化感作用研究[J].西北农业学报,2007,16(3):215-218.

[14] 高兴祥,李美,于建垒等.小飞蓬提取物除草活性的生物测定[J].植物资源与环境学报,2006,15(1):18-19.

[16] Saxena A,Singh D V,JoshiN L.Autotoxic effects of pearlmillet aqueous extractson seed germination and seedling growth[J].Journal of Arid Environments,1996,33:255-260.

[17] LisA,Piggott J R,Góra J.Chemical composition variability of the essential oil of ConyzAcanadensis Cronq.[J].Flavour and Fragrance Journal,2003,18:364-367.

[18] 李霞.萜类化合物对植物的化感作用[J].通化师范学院学报,2006,27(2):80-81.

[19] 张学文,刘亦学,刘万学,等.植物化感物质及其释放途径[J].中国农学通报,2007,23(7):295-297.

[20] 王延鹏.植物间化感作用研究概况 [J].山东林业科技.2008,176(3):84-88.

[21] 邓芹英,刘岚,邓慧敏.波谱分析教程 [M].2版.北京:科学出版社,2007:261-275.

[22] 朱淮武.有机分子结构波谱解析[M].北京:化学工业出版社,2005:273-277.

[23] 孟令芝,龚淑玲,何永炳.有机波谱分析[M].2版.武汉:武汉大学出版社,2003:14-51.

[24] 王光辉,熊少祥.有机质谱解析 [M].北京:化学工业出版社,2005:130-160.