九龙藏黄牛和九龙牦牛β-酪蛋白基因型分析

赵梦波，金素钰，黄 林，郑玉才

西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041

0 引言

牛乳蛋白主要包括酪蛋白（Casein，CN）和乳清蛋白两大类，前者分为αs1-酪蛋白（αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-CN）、β-酪蛋白（β-CN）和κ-酪蛋白（κ-CN）四种类型。牛β-CN有209 个氨基酸，由位于6号染色体上的CSN2基因编码，约占牛乳总酪蛋白的40%，有着重要的生理功能[1～3]。目前β-CN已鉴定出13 种遗传变异体，包括A1、A2、A3、A4、B、C、D、E、F、H1、H2、I和G，最常见的是A1和A2[4]，很多研究也主要涉及这两种类型。牛β-CN的A1遗传变异体在消化过程中会产生β-酪啡肽-7（BCM-7），具有很强的阿片活性，被认为与胃肠道炎症、糖尿病、自闭症、精神分离症等发生有关，而A2遗传变异体则基本不会产生BCM-7[5～7]。还有研究表明，β-CN的遗传变异体还可能会影响牛乳的凝固特性、酪蛋白胶束大小等[8，9]。

牛β-CN不同遗传变异体的等位基因频率与牛品种等有关。有研究显示，意大利荷斯坦牛β-CN的A1等位基因频率为0.371 0，低于A2等位基因频率（0.546 0）；荷兰荷斯坦牛A1和A2等位基因频率分别为0.402 0和0.598 0，而美国荷斯坦牛的A1等位基因频率高于A2[10]。德国的瑞士褐牛β-CN的A1、A2等位基因频率分别为0.108 0和0.705 0，西门塔尔牛A1、A2等位基因频率分别为0.343 0和0.566 0，娟珊牛A1、A2等位基因频率分别为0.093 0和0.721 0[11]。中国荷斯坦牛A1、A2等位基因频率分别为0.694 0和0.289 0，娟姗牛分别为0.325 0和0.421 0[12]。还有报道显示，水牛乳β-CN可能只有A2遗传变异体，A4型只在韩牛中检测到[13，14]。由此可见，牛乳β-CN的遗传变异体的频率在品种间存在很大差异。

九龙藏黄牛和九龙牦牛生活在高寒、低氧的特殊环境中，有关其β-CN多态性研究不多。本试验对生活于同一地区两种牛的β-CN的遗传多态性进行分析，以期为九龙藏黄牛和牦牛乳的比较生化研究、遗传育种等提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集和处理

九龙藏黄牛乳样（n=42）和九龙牦牛乳样（n=17）均采自四川省九龙县，所选试验牛均为常年放牧，无补饲。清晨手工挤乳，每头牛采集乳样约50 mL，冰冻带回实验室。参照文献方法[15]制备酪蛋白，冻干后于-80 ℃保存。

1.2 β-CN 多态性检测

参考文献方法[16]，取10 mg试验牛酪蛋白冻干粉溶于1 mL 6.6 mol/L尿素溶液中。在电泳前45 min，将5 μL的β-巯基乙醇和少量的碱性品红溶液和蔗糖加入到15 μL上述酪蛋白溶液中；取2 μL处理后的样品用7.5 %酸性尿素PAGE分离，180 V电泳1 h，之后用考马斯亮蓝G-250染色。根据电泳图参考相关文献确定β-CN变异体类型[17，18]。

1.3 数据处理

参考文献[19]计算试验牛β-CN的等位基因频率和基因型频率。

2 结果

2.1 β-CN 基因型

酸性尿素PAGE电泳结果显示，藏黄牛β-CN的基因型有7 种，包括A1A1、A1A2、A1B、A2B、BB、A1C、BC基因型（图1A），九龙牦牛β-CN的基因型有2 种，包括A1A2、A2A2基因型（图1B）。另在图1B中发现，与九龙藏黄牛相比，九龙牦牛的电泳图谱各条带位置略微靠上，即相同遗传变异体的迁移率小些（图1B中6、7、8泳道）。

图1 九龙藏黄牛（A）和九龙牦牛（B）β-CN 的电泳图谱

2.2 基因型频率和等位基因频率

九龙藏黄牛β-CN的7 种基因型频率见表1。有4 种基因型仅存在于1 个个体中，其中A1A1为优势基因型，50%以上的个体都是这种基因型；A1为优势等位基因，频率高达0.702 0，而A2等位基因的频率仅为0.023 8。九龙牦牛β-CN的2 种基因型频率接近（表1），但A2等位基因频率具有明显优势，频率高达0.765。

表1 九龙藏黄牛和九龙牦牛β-CN 基因型频率和等位基因频率

3 讨论

本试验对九龙藏黄牛和九龙牦牛β-CN基因型进行分析，发现在九龙藏黄牛中，A1等位基因占明显优势。这是首次有关九龙藏黄牛β-CN A1、A2遗传变异体的报道；在九龙牦牛中A2等位基因占明显优势，这与已有报道中A2为优势等位基因的结果一致[20]。在毛永江等[21]研究中，认为九龙牦牛β-CN无遗传变异体，可能与试验检测方法不同有关。九龙藏黄牛产奶量较低，国内对其β-CN的遗传变异体的报道很少。在青海地区黄牛乳蛋白多态性研究中，发现β-CN有A、B两个等位基因，其中A占绝对优势[22]。李玉萍等[23]研究发现，九龙藏黄牛β-CN的A等位基因频率为0.965 0，B等位基因频率为0.069 8，其结果与青海本地黄牛相似。本试验检测到九龙藏黄牛A1、A2遗传变异体，但A2变异体的等位基因频率很低。由于A2遗传变异体可能有益于人体健康[1，24]，因此，如果从乳的开发利用角度进行九龙藏黄牛的育种，应充分考虑这一点。另外本试验结果表明，九龙藏黄牛和九龙牦牛虽然生活在相似的生态环境中，但两者β-CN的优势等位基因却差别很大，提示二者相对独立的进化特征，这对认识高原地区藏黄牛和牦牛的生物多样性具有参考价值。

含有β-CN的A1和A2遗传变异体的乳被分别称为A1型乳和A2型乳，二者只在β-CN第67位存在一个氨基酸差异，A1型为组氨酸，A2型为赖氨酸[25]，但其对人体健康的潜在影响却不相同。有研究发现，A1型乳的消化特性会引起健康问题[5]。人体饮用A1型乳会引起小肠炎症，其机制可能是通过下调乳糖酶表达加剧乳糖不耐受的症状，而饮用A2型乳可以减轻胃肠道相关症状[26，27]。另有研究认为，A1型β-CN及其代谢产物BCM-7是导致1型糖尿病的重要原因[28]。本试验结果从蛋白质水平上证实，九龙牦牛乳中的β-CN可能更有益于人体健康。

本试验中九龙藏黄牛酪蛋白的电泳条带整体上要比九龙牦牛的迁移更快。将黄牛CSN2和牦牛CSN2的 CDS区（NCBI：NC_037333.1和GenBank：MH378280.1）进行比对发现，个别碱基发生变化，翻译成蛋白质序列后进行分析，发现黄牛和牦牛β-CN等电点分别为6.63和6.25，而本试验的电极缓冲液pH值为3[16]，故九龙藏黄牛酪蛋白的迁移速率要比九龙牦牛大。

4 结论

本试验表明九龙藏黄牛和九龙牦牛β-CN均存在多态性，共检测到4 种等位基因：A1、A2、B、C，其中九龙藏黄牛表现出7 种基因型：A1A1、A1A2、A1B、A2B、BB、A1C、BC，优势等位基因为A1；九龙牦牛β-CN的基因型有2 种：A1A2、A2A2，优势等位基因为A2。这为九龙藏黄牛和九龙牦牛乳的比较生化研究及遗传育种研究提供参考。