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北京地区荷斯坦牛白细胞黏附缺陷症的检测分析

时间:2024-07-28

文∕杨宇泽 冯 涛 肖 炜 靳月生 路永强

(1北京市畜牧总站;2北京市农林科学院畜牧兽医研究所;3北京市昌平区农业局)

牛白细胞黏附缺陷症(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency,BLAD)是一种发生在荷斯坦牛群中的遗传性免疫缺陷病,是一种由常染色体上单基因控制的隐性遗传疾病。患病牛只临床表现为严重的重复性感染、脓液形成减少、伤口愈合延迟和白细胞增多,也表现为犊牛初生重低和发育不良等症状。BLAD最早由Hagemoser等[1]发现,该病在日本、美国、丹麦、荷兰、德国、瑞士、土耳其、中国[2,3]、印度[4]、捷克[5]等国均有发生。

BLAD是由于牛1号染色体上编码整合素β亚单位(CD18)的第383位碱基由A突变为G,使与之相应的位于胞外高度保守区的第128位天门冬氨酸变成了甘氨酸,最终导致白细胞表面整合素的β2亚单位表达明显减少或缺乏而引起的临床发病。该突变导致CD18基因上TaqI酶切位点的消失。据此,通过检测北京郊区荷斯坦母牛CD18A383G基因型,为进行遗传改良和淘汰含BLAD基因的奶牛个体提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采集北京市延庆县A奶牛场、B奶牛场及昌平区C奶牛场共502 份健康荷斯坦母牛抗凝血样,利用血液基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司,北京)抽提血液基因组DNA。

1.2 方法

根据Genbank中牛CD18(NM_175781)基因序列,用Primer 5.0软件设计引物,引物序列为:F:5′-CAGGTCAGGCAGTTGCGTTCAAT-3′;R:5′-GGTTTCAGGGGAAGATGGA GTAG-3′。PCR产物大小206 bp,位于CD18基因第二外显子区。反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,64 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s,35 个循环;72 ℃延伸7 min。

对502 份荷斯坦母牛血液基因组DNA 进行PCR 反应,对PCR反应产物进行酶切,经Taq I(Takara)酶切后理论上可以呈现3 种基因型,即野生型(AA)150/56 bp、杂合型(AG)206/150/56 bp和突变型(GG)206 bp。酶切后的杂合型和突变型个体全部经PCR产物测序再次确认,以确保结果准确无误。

2 结果

在检测的3 个奶牛场中,延庆A奶牛场未检测到携带BLAD基因的个体;延庆B奶牛场中检测到2头携带BLAD杂合基因个体;昌平C奶牛场中检测到3 头携带BLAD基因的杂合个体。杂合子个体PCR产物序列测定结果见图1,图中最中间的碱基测序图呈现2 个明显的波峰,其中绿色的峰代表A碱基,黑色的峰代表G碱基,即表示在该位点为杂合子突变。在3 个奶牛场中共检测到2 种基因型,AA和AG,未检测到GG基因型。检测群体中BLAD基因的携带率为3.1%。图2为荷斯坦牛CD18基因PCR-RFLP检测的琼脂糖凝胶电泳图。表1为3 个奶牛场奶牛BLAD基因频率统计分析。

图1 AG 杂合子个体PCR 产物序列测定结果

图2 荷斯坦牛CD18 基因PCR-RFLP 检测琼脂糖凝胶电泳图

表1 3 个奶牛场奶牛BLAD 基因频率统计分析

3 讨论

牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)纯合子基因突变可导致犊牛早期死亡,严重影响了奶牛的育种生产成本,降低了奶牛生产效率。但由于该突变基因为隐性遗传,一般常规的方法无法确定病症。因此,用分子检测手段对奶牛群进行牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)突变基因检测尤为重要。

李艳华等[2]检测了北京市荷斯坦公牛BLAD基因,发现了1 头BLAD基因携带者,BLAD基因的检测率为1.9%(1/54)。王洪梅等[3]检测了济南市周边11 个奶牛场356 头荷斯坦母牛和山东奥克斯荷斯坦奶牛公牛站的53 份公牛冻精,结果发现有3 头母牛携带BLAD基因,检出率为0.8%,公牛均不携带BLAD基因。王洪梅等[6]对天津和山东的荷斯坦母牛进行了检测,BLAD基因的携带率为0.69%(3/436)。近期,李艳华等[7]检测了北京奶牛中心246 头荷斯坦公牛和北京地区高产奶牛群409 头母牛,结果发现公牛群BLAD基因携带率为0.41%,母牛群BLAD基因携带率为3.91%。

综合以上研究可以看出,北京市荷斯坦牛群体中公牛BLAD基因的携带率较六七年前有所降低,但还没有达到彻底净化的程度,特别是在母牛群中,携带者频率长期达到3.0%以上。此外,本研究中荷斯坦母牛BLAD基因携带率与李艳华等[7]研究结果相似,说明在京郊地区规模化奶牛场使用的公牛冻精中BLAD基因没有得到彻底净化,导致母牛群体中BLAD基因携带率在3%以上。所以在奶牛育种和生产中,应有计划地淘汰携带BLAD基因的个体,净化京郊荷斯坦牛群体。

[1]Hagemoser W A,Roth J A,Lofstedt J,et al.Granulocytopathy in a Holstein heifer.J Am Vet Med Assoc,1983,183(10):1093-1094.

[2]李艳华,张胜利,韩广文,等.利用单链构象多态性检测牛白细胞黏附缺陷症方法的建立.遗传,2007,29(12):1471-1474.

[3]王洪梅,李建斌,高运东,等.中国荷斯坦牛白细胞黏附缺陷症基因检测方法的建立与应用.河北保定:中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集.2006:417-420.

[4]Patel R K,Singh K M,Soni K J,et al.Low incidence of bovine leukocyte adhesion deficiency(BLAD)carriers in Indian cattle and buffalo breeds.J Appl Genet,2007,48(2):153-155.

[5]Citek J,Rehout V,Schröffelová D,et al.Frequency of BLAD and CVM alleles in sires and elite heifers of Czech Holstein cattle.Dtsch Tierarztl Wochenschr,2008,115(12):475-477.

[6]李艳华,朱玉林,张胜利,等.北京地区荷斯坦牛BLAD遗传缺陷基因的分子筛查.中国奶牛,2013(1):17-20.

[7]王洪梅,李建斌,许尚忠,等.中国荷斯坦牛白细胞黏附缺陷症PCRRFLP检测.生物技术通报,2007(3):155-159.

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