Soleris检测技术在生乳细菌总数快速测定中的应用

文∕何 瑛 林木娣 吴 腾 邢益俊

（广东燕塘乳业股份有限公司检测中心）

牛奶富含多种营养物质，被称为“白色血液”，是为数不多的全价食品之一，也是微生物生长繁殖的良好培养基，一旦与外界接触就极易受到污染，细菌总数是其卫生质量的重要监控指标。

国标GB 19301—2010规定，当生乳中细菌总数达到2×106CFU/mL时，牛奶的质量安全就会受到威胁，此时生乳不允许用作原料乳。生乳的细菌总数与乳制品后期生产加工及储存密切相关，细菌总数过多，生乳容易发生酸败，导致保质期缩短、蛋白质热稳定性下降而无法加工或者在加工过程中需要更苛刻的条件才能达到灭菌效果，不仅破坏了牛奶的营养成分，还可能由于灭菌不完全带来潜在质量问题。此外，生乳中大量的细菌生长繁殖极易产生耐热性的酶及毒素，它们经超高温处理后仍有残留，容易引起UHT产品在货架期内变质或导致消费者中毒事件发生[1]。

检测生乳中细菌总数的方法很多，传统的平板计数法是应用最广泛的，但该法需48 h才能完成菌落计数，不能及时把握原料乳的卫生质量状况。近年来，细菌总数的快速检测技术得到了很大的发展，如电化学阻抗法[2]、ATP生物发光法[3]、流式细胞计数法[4]、还原法[5]、微生物自动检测仪等[6]。Soleris实时光电微生物快速检测系统是一种新兴的微生物自动检测技术，它基于传统的培养基理论和染色技术，并结合了光电检测技术和计算机控制的模块化分析系统研发而成，被UPS推荐为替代传统平板的有效方法之一，在国外已成功应用于液态奶中微生物的检验[7]。本文参照国标GB 4789.2—2010方法和Soleris方法进行同步实验，研究建立Soleris系统快速检测生乳中细菌总数的方法模型，为生乳细菌总数的测定提供了一种简单、快速、准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生乳

采自广东、福建、广西等地的大型奶牛场。

1.1.2 试剂

平板计数琼脂（PCA，北京陆桥），0.85%灭菌生理盐水，Soleris细菌总数试剂瓶（美国Neogen公司）。

1.1.3 仪器设备

移液枪（德国Brand），涡旋振荡器（海太牌），恒温培养箱（上海一恒）；

Soleris实时光电微生物快速检测系统，美国Neogen公司生产，可内置128个试剂瓶，光电检测器每隔6 min监测试剂瓶底部琼脂栓的颜色变化并传输到计算机。

1.2 方法建立

1.2.1 工作原理

Soleris系统在预制的试剂瓶中放入营养培养基（内含以葡萄糖为碳源的蛋白胨酵母抽提物）和pH值指示剂（溴甲酚紫），在35℃培养环境下，样品中的细菌在Soleris试剂瓶中增殖，分解葡萄糖产酸使pH值改变，继而引起指示剂颜色的变化，通过系统自带的光电系统监测试剂瓶底部琼脂栓颜色发生改变的时间来计算样品的细菌数。

1.2.2 标准曲线的制备

本实验将取自各地牧场的细菌数各异的生乳样品，按照GB 4789.2—2010的方法[8]选择合适的稀释度进行平板培养，同时取1 mL样品原液加入Soleris菌落总数检测试剂瓶中，上机检测。国标方法获得样品细菌总数（CFU/mL），Soleris仪器获得相应的琼脂栓变色时间（DT），由此建立细菌总数和DT之间的对应关系，剔除偏离回归曲线较大的点，制成标准曲线用于样品的定量检测。

1.2.3 仪器重复性试验

选取细菌数在不同数量级的样品，标号为A1～A9，使用Soleris系统分别重复测定3 次，将得到的结果进行统计学分析，相对标准偏差用RSD表示。

1.2.4 标准曲线的验证

调试仪器处于正常的检测状态，随机选取不同时期各奶牛场的生乳样品不少于30个，同时按照Soleris仪器法和国标平板计数法对样品细菌总数进行检测，记录仪器检出时间（DT），将DT值代入标准曲线中得到仪器菌落数，与对应的平板法菌落总数进行比较，并对2 组数据进行统计学分析。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

选取来自广东、福建、广西等地牧场的生乳样品共102个，将样品在Soleris仪器上测得的指示剂变色时间（DT）设为横坐标，国标平板计数法测得的细菌总数结果（CFU/mL）取对数值（Log CFU）后设为纵坐标，得到Log CFU与DT值之间的标准曲线如图1所示。

对Soleris仪器法与国标法的结果进行回归分析，得到生乳细菌总数检测标准曲线为：Log CFU＝7.634－0.472×DT，相关系数R2＝－0.93，表明2 种方法所得结果具有较好的相关性，相关系数为负数，即细菌数与DT值为负相关，细菌数越高检测时间越短，有利于加快企业对高污染生乳样品的预警。

由标准曲线可得，国标生乳细菌总数的限量水平为2×106CFU/mL，DT值约为2.8 h；若设定生乳细菌总数低于5×105CFU/mL，DT值约为4.1 h；当生乳细菌数低至103CFU/mL[1]时，DT值约为9.8 h，同国标方法完成菌落计数所需48 h相比，Soleris方法可以大大缩短检测时间。

图1 生乳细菌总数检测标准曲线

2.2 Soleris 仪器法重复性实验

随机选取生乳样品9个，编号为A1～A9，使用Soleris系统分别重复测定3 次，得到的数据见表1。该方法测得数据的RSD值均在5%以内，表明仪器检测结果的重复性良好。

2.3 标准曲线的验证

为了验证标准曲线的合理性，随机抽取各奶牛场生乳样品51 批次进行Soleris仪器法检测，得出DT值代入标准曲线方程求出细菌总数，同时进行国标法平板计数，验证结果见表2。由于微生物检测存在一定的误差，2 种方法测得结果的对数值可接受偏差范围为±0.5，由表2可以看出，2 组对数值偏差的绝对值均小于0.5。认为标准曲线的准确度达到检测要求；对2 组细菌总数作t检验，t＝1.869＜t0.05/2.50=2.009（P＜0.05），表明2 组数据之间没有显著性差异，Soleris法可以满足生乳中细菌数检测的定量要求。

3 总结

表1 仪器法重复性实验（n ＝3）

3.1 本实验建立了Soleris仪器法快速检测生乳中细菌总数的方法模型，该方法操作简便、实时快速，可进行批量检测，与国标法有较好的一致性，重复性良好且自动化程度高，能有效避免人为误差，对于生乳细菌总数检测具有良好的适应性，为企业快速评估生乳的卫生质量状况、指导生产、控制产品质量安全提供了决策依据。

3.2 Soleris法使用的关键是建立一条覆盖面广、具有代表性的标准曲线。曲线的相关系数不仅取决于2个方法之间的相关性，更与参与分析的样品数量、样品细菌数范围、传统平板计数结果的准确性等因素息息相关。随着分析样品数量的增加，样品细菌数范围覆盖5～6个指数级，标准曲线描述的2 种方法之间的关系就越可靠，因此在日常检验的过程中应不断添加新数据以完善标准曲线。

3.3 由于各奶牛场奶牛品种、饲养条件、环境卫生等的差异，污染生乳的细菌来源复杂，不同牧场的生乳样品菌相不尽相同，对于标准曲线的适用性也有一定的差异，当需要检测新来源的生乳样品时，需要通过验证实验对曲线进行校正或者重新制作标准曲线。

表2 标准曲线验证结果

[1]汪银锋，李素平，高腾云，等.原料乳卫生指标与质量关系的研究.江西农业学报，2009，21（8）：147-149.

[2]易敏英，李志勇.电阻抗法快速检测鲜牛奶中细菌总数.中国乳品工业，2001，29（3）：30-31.

[3]李春艳，霍贵成，王德国，等.ATP生物发光法快速测定生乳中微生物总数的研究.食品工业科技，2008，29（7）：233-238.

[4]王宁，刘宁.流式细胞术快速检测生乳中细菌总数.食品工业科技，2007，28（9）：197-200.

[5]富鑫，田雨，管勇佳，等.生乳细菌总数检测仪测定生乳细菌总数的应用.食品工业科技，2012，33（2）：70-72.

[6]孔丽娜，李祖明，吴聪明，等.生乳微生物快速检测技术研究进展.食品研究与开发，2013，34（24）：268-271.

[7] 北京安普生化科技有限公司.Soleris系统在乳制品微生物快速检测领域的应用.食品安全导刊，2012（7）：34-35.

[8]中华人民共和国卫生部.GB 4789.2-2010 食品微生物学检验 菌落总数测定.北京：中国标准出版社，2010.