乳蛋白中主要组分及检测方法

文 / 吴 敏 王钦权 胡子航 胡方圆

（1浙江省质量检测科学研究院；2杭州娃哈哈集团有限公司）

牛乳是奶牛乳腺分泌的一种白色或稍带黄色的不透明液体，含有其幼崽生长发育所需的全部营养，已经逐渐成为现代人饮食当中的主要食品之一。我国相关国家标准规定，收购的生牛乳的蛋白质含量≥2.8 g/100g，脂肪含量≥3.1 g/100g，非脂乳固体含量≥8.1 g/100g。乳中最主要的营养物质为蛋白质、脂肪，同时乳中的矿物质、维生素也受到广泛重视，乳中的钙含量尤其突出，牛乳常作为强化钙的营养食品。近年来，乳中的免疫物质、功效物质也越来越受到重视，特别是牛初乳中的免疫蛋白、乳铁蛋白等，更是成为了附加值极高的功能性产品。

牛乳的成分十分复杂，已知的至少有上百种化学成分，这些物质在牛乳中按不同的形态分布，使其成为一种复杂的胶体物质。牛乳中最主要的营养指标为蛋白质，牛乳中蛋白质含量为2.8%～3.8%，其中95%是乳蛋白，5%为非蛋白态氮[1]。乳蛋白富含所有必需氨基酸，同时由于其分子相对较小，人体吸收率高，对必需氨基酸的利用程度高，是一种优质的完全蛋白。

1 乳蛋白的分类

乳蛋白在乳中呈现多种分布状态，有酪蛋白、乳清蛋白、脂肪球膜蛋白等。

酪蛋白（casein）是指在20 ℃时用酸将脱脂乳pH值调节至4.6时，沉淀的一类蛋白质，占乳蛋白总量的80%～82%。酪蛋白大部分与磷酸钙形成酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体，胶粒呈球状胶束状态，在电子显微镜下观察直径为30～300 nm，在乳中呈两性电解质特性。故当调节pH值为酪蛋白等电点时，蛋白质之间的电荷排斥力消失，酪蛋白相互吸引从而沉淀[2]。在中性条件下，酪蛋白胶粒对热稳定，140 ℃处理15～20 min不会导致酪蛋白热凝固。但在实际加热过程中，乳糖热降解会使pH值降低，乳清蛋白变性后附着于酪蛋白上，酪蛋白胶粒的水合作用降低，这些条件的加和都会引起酪蛋白之间的交联从而析出[3，4]。

乳清蛋白含量占乳蛋白的18%～20%，乳除去酪蛋白后剩余的蛋白质称为乳清蛋白。乳清蛋白分子水合能力强，分散度高，在乳中呈现典型的高分子溶液状态。乳清蛋白也可分为热稳定及热不稳定2 类。将乳清煮沸20 min，调节pH值到4.6～4.7，此时沉淀的蛋白质属于热不稳定蛋白，约占乳清蛋白的81%，包含中性时加入饱和硫酸铵盐析出的乳球蛋白和呈溶解状态的乳白蛋白。乳清蛋白还包括对热稳定的小分子蛋白和胨[5]。

脂肪球膜蛋白吸附于脂肪球膜上，它们与磷脂质以1 分子磷脂质约2 分子蛋白质结合在一起，是脂肪球膜的一个重要组成部分。脂肪球膜蛋白对热比较敏感，且含有较多的硫，加热过程中易发生变性，引起脂肪球膜之间的交联[5]。嗜乳脂蛋白是脂肪球膜蛋白上含量最多的一种，占总量的40%左右，对乳汁分泌具有重要作用。位于脂肪球膜上的脂肪酸结合蛋白（FABP）在较低的浓度下就能抑制乳腺癌细胞的生长[6]，脂肪球膜蛋白的分离较为复杂，需要提取脂肪球后，在低温状态下采取搅拌、冻融、极性质子溶剂等多种方法破坏脂肪球膜，而后高速离心，改变pH值或盐析离心的方式分离脂肪球膜蛋白[7]。

2 乳蛋白的测定

在我国，牛乳中蛋白质的测定采用GB 5009.6—2010《食品中蛋白质的测定》，主要原理是将样品中氮元素提取测定，乘以换算系数，得到乳中蛋白质的含量，现最常用的是凯氏定氮法。由于元素守恒原理，如果样品中掺杂有非蛋白氮类物质，测定结果会偏高。但是氮元素法无论蛋白质的构型和存在方式如何，均能较精准的测定，现在依然作为我国法定的检测方法普遍应用。

近年来，由于乳中非蛋白氮掺假较多，因此，对乳中蛋白质的检测方法的研究也增多了，最常用的是根据蛋白质的特定结构、特定氨基酸残基等特殊构型，促使其与试剂反应显色，在一定波长下测得吸光度，得到其含量，例如紫外法、福林酚法、双缩脲比色法[8]、染料法等，都是采用这一原理直接测定乳中蛋白质含量。另外，也有利用电泳等方法将乳蛋白分离测定，例如唐萍等用毛细管电泳法测定奶制品中蛋白质的含量，将牛乳中5 种蛋白质进行分离，而后对比标品峰面积，得到其含量[9]；秦立虎、田志梅、唐伟英等利用甲醛滴定蛋白质的氨基酸残基，与凯氏定氮做对比得到经验常数，计算出牛乳中蛋白质的含量[10～12]。但由于乳中物质复杂，对许多方法的干扰也较大，因此，这些方法仅作为研究手段，还未能作为官方规定的测定方法得到普遍应用。

目前，美国生鲜乳收购标准对蛋白质采用两步测定法，即先用三氯乙酸沉淀牛乳中蛋白质，而后分别测定沉淀及上清液蛋白质含量，利用差值得到乳中真蛋白含量。此法由于可以排除非蛋白氮的干扰，已在国外较多国家广泛引用[13]。

3 乳蛋白中的其它特殊功能性物质

乳蛋白中还有一些特殊的功效成分，例如乳铁蛋白、免疫球蛋白等。其属于蛋白质构型，但又具有特殊的功效。

乳铁蛋白是乳清蛋白的一种，广泛存在于各种乳中，人乳中含量较高。现市场化的乳铁蛋白一般都是从牛初乳中提取分离，可采用色谱法（吸附、离子交换、亲和色谱等），超滤，盐析，酸沉降等方法分离，其中超滤是工业化分离乳铁蛋白最合适的方法[14]。乳铁蛋白可逆性地与铁离子结合，防止铁离子刺激肠胃并促使铁的吸收利用，在婴幼儿乳粉市场具有较大的应用空间，已作为一种营养强化剂广泛应用于各类婴幼儿食品中。同时乳铁蛋白还有广谱抗菌、调节免疫和抗病毒等多种作用[15]。乳铁蛋白分子主体是一个约有700 个氨基酸残基构成的多肽链，分子量约为80 KU[15]，可根据其特殊的性质将其从蛋白质中分离出来，而后测定其含量。现无任何国家标准或行业标准规定其检测方法，主要是由各个企业制定企业标准。纯乳铁蛋白粉的检测可使用反相高效液相层析法测定，食品中乳铁蛋白的测定可采用高效毛细管电泳法和酶联免疫法。这几种方法也是申报乳铁蛋白新资源食品时申报企业采取和提供的方法。

免疫球蛋白在牛初乳中含量较高，有IgG，IgA，IgM，IgE，IgD等，IgG是含量最高的免疫球蛋白，可占到总量的55%以上。在牛初乳中，lgG的含量可达到50～90 mg/mL[16]。IgG可与相应抗原特异性结合，在体内介导各种生理和病理效果，使入侵人体的病毒丧失破坏机体健康的能力，并能促使吞噬细胞对细菌等颗粒性抗原的吞噬，增强人体的抵抗力。但由于提取高纯免疫球蛋白成本极高，市面上主要的免疫球蛋白产品都是以牛初乳为基质，而2012年我国卫生部对质检总局的复函称，婴幼儿配方食品中不得添加牛初乳以及用牛初乳为原料生产的乳制品。这在一定程度上限制了免疫球蛋白的销售。

GB/T 5009.194—2003规定了保健食品中免疫球蛋白IgG的测定方法，方法适用于片剂、胶囊、粉末等类型的产品，使用的高效液相色谱法，采取梯度洗脱测定IgG的含量。GB/T 21033—2007规定了饲料中IgG的测定，也采用高效液相色谱法，最低检出限可达到0.5 mg/mL，也有单向免疫扩散法（SRID）[16]、酶联免疫吸附法、电泳法等。

4 结语

乳蛋白是极富营养价值的蛋白质之一。在欧美、日本等发达国家，乳制品作为每日必需摄入的食品受到相当程度的重视。目前，我国居民的人均蛋白质每日摄入量为76 g，其中来自奶类产品的蛋白质仅为1.5 g，而发达国家则高达15 g；中国人均奶类消费量只有世界平均水平的20%左右，还有很大的增长空间。同时，国家对乳品的质量安全加强了监管，并督促各检测机构加快对乳品质量控制方法和检验测定方法的研究。研究乳蛋白的性质及检测方法，同时研究分离乳中各种特殊功能蛋白质的方法，对乳蛋白的广泛应用具有重要意义。

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