HPLC测定生鲜乳中氨苄西林残留方法的研究

文 / 刘维华 夏淑鸿 赵 娟 高建龙 武晓宏 宁夏兽药饲料监察所

氨苄西林，又称氨苄青霉素，是β-内酰胺类青霉素的一种。氨苄西林属于广谱抗生素，对草绿色链球菌、白喉杆菌、破伤风杆菌和放线菌的杀伤作用与青霉素相当，对肠球菌及李斯特菌的杀伤作用优于青霉素，而对耐药葡萄球菌及其它能产生青霉素酶的细菌无作用。氨苄西林对革兰氏染色阴性细菌有效，但易产生耐药性。

氨苄西林的副作用主要表现为易使人体产生过敏反应，且发生率较高，可达10%以上，多发生于用药后5 天，症状以皮疹、荨麻疹或斑丘疹为最常见，偶见过敏性休克。

氨苄西林广泛用于奶牛的巴氏杆菌病、肺炎、乳腺炎、子宫炎、肾盂肾炎、沙门氏菌肠炎的治疗。如果养殖者对休药期的规定执行不严格，就增大了氨苄西林残留于生鲜乳中的隐患。氨苄西林的分子式为（2S，5R，6R）-3，3-二甲基-6-[（R）-2-氨基-2苯乙酰胺基]-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚烷-2-甲酸的三水化合物。NY/T 829—2004规定使用高效液相色谱检测牛奶中氨苄青霉素的残留。文本为了更好地应用HPLC，指导实验室工作，对其进行了方法学研究，现将试验结果汇报如下。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂

1.1.1 主要仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（配FLD检测器和ALS自动进样器）；高速冷冻离心机（HITACHI）；WSZ-100-A振荡器（上海安亭科学仪器厂）；移液器（Fin npipette）；水浴锅。

1.1.2 主要试剂

氨苄西林对照品（C16H19N3O4S·3H2O）：含量85.8%，批号K0210906，中国兽医药品监察所提供；乙腈为色谱纯；三氯乙酸、甲醛溶液、浓磷酸、磷酸氢二钾均为分析纯；去离子水。

1.2 溶液制备

1.2.1 标准溶液制备

精密称取氨苄西林对照品58.27 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀即得1000 μg/mL氨苄西林储备液；精密量取储备液100 μL，置50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，即为2 μg/mL氨苄西林工作液。

分别精密量取2 μg/mL氨苄西林工作液1.0、2.5 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，得0.2、0.5 μg/mL氨苄西林标准阳性添加溶液。

分别精密量取2 μg/mL氨苄西林工作液5、10、20、50、100、150、200、250 μL，置 10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，得1、2、4、10、20、30、40、50 μg/L氨苄西林标准系列溶液。

1.2.2 阳性添加试料制备

精密量取0.2、0.5 μg/mL氨苄西林工作液100 μL，置于4.90 mL离心后的空白生鲜乳中，使之成为4、10μg/L的阳性添加试料。

1.2.3 其它试剂配制

磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L）：称取2.7218 g磷酸二氢钾置于1000 mL容量瓶中，加水900 mL，用54%磷酸调pH值至3.50±0.05，加水定容至刻度。

三氯乙酸水溶液（20%）：称取10 g三氯乙酸至50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀。

三氯乙酸水溶液（75%）：称取35.5 g三氯乙酸置于50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀。

甲醛水溶液（7%）：量取37%甲醛9.5 mL置于50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀。乙腈水溶液（20%）：量取10 mL乙腈至50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀。

1.3 试验步骤

取生鲜乳适量，以3500 rpm离心10 min除脂，精密量取5.00 mL下层溶液，置于塑料离心管中，加75%三氯乙酸水溶液0.50 mL，剧烈漩涡30 s。以6500 rpm离心10 min沉淀蛋白，精密量取上清液1.00 mL于10 mL螺口玻璃离心管中。

在盛有1.00 mL上清液或标准工作液的螺口玻璃离心管中，加入20%三氯乙酸水溶液0.20 mL和7%甲醛水溶液0.20 mL，剧烈漩涡30 s。加盖拧紧封口后，置沸水浴中衍生化30 min，取出，冷却至室温，加入20%乙腈水溶液0.60 mL，漩涡混匀10 s，经0.45 μm亲水性微孔滤膜过滤后作为待测溶液，用HPLC测定。同步作空白样品和空白添加样品的测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18-C18，（4.6×250）m m；流动相：0.02 mol/L磷酸盐缓冲溶液-20%乙腈溶液（75%+25%）；流速：1.0 mL/min；进样量100μL；荧光检测器激发波长346 nm，发射波长422 nm；进行多点校准，以色谱峰面积积分值定量。

1.5 计算

阳性添加试料回收率计算公式：R=K·（X- X0）/C×100%，公式中：

X：试样多点校准测定值（μg/L）；

X0：空白多点校准测定值（μg/L）；

C：阳性添加实际浓度（μg/L）；

K：稀释倍数（5.00+0.50）/5.00=1.1。

2 试验结果

2.1 标准曲线

在上述色谱条件下，测定标准系列溶液吸收峰，氨苄西林的保留时间为6.1 min[色谱柱（4.6×250）mm，保留时间为9.7 min]，回归方程为：

Y=68.11193 X+20.03117（R=0.99987）

氨苄西林液相色谱具有良好的响应值，理论板数为15200，峰面积与系列标准浓度呈良好的线性关系，线性范围为1～50 μg/L。以3 倍信噪比计算求得仪器检出限（LOD）为1 μg/L，以10 倍信噪比计算求得定量限（LOQ）为2 μg/L。

2.2 加标回收率

在空白试料中做4和10 μg/L 共2 个水平的阳性添加，每水平做5 份平行样品，每份结果取平均值，考察3 批。氨苄西林的回收率、批内变异系数、批间变异系数见表1、2。

表1 氨苄西林4 μg/L添加样品的结果

表2 氨苄西林10 μg/L添加样品结果

2.3 不同系列浓度的氨苄西林溶液的稳定性

对不同系列浓度的氨苄西林溶液室温（12～24 ℃）放置36 h，相同HPLC条件间隔测定，考察其稳定性。结果见表3。

表3 不同浓度氨苄西林36 h色谱峰面积变化情况

2.4 色谱柱的影响因素

用Z O R B A X S B-C18，（4.6×250）m m和Z O R B A X SB-C18，（4.6×150）mm色谱柱，分别测定氨苄西林阳性添加各5 批，使用相同色谱条件，分别做标准曲线多点校准，测定相同阳性添加样品，加标回收率有一定差异。结果见表4。

表4 使用不同色谱柱的加标回收率测定结果比较

3 分析讨论

3.1 生鲜乳样品经高速冷冻离心除脂，三氯乙酸溶液沉淀蛋白，得到较好的提取净化。上清液中的氨苄西林与甲醛溶液在酸性条件下，加热衍生化，生成2-羟基-3-苯基-6-甲基吡嗪（氨苄西林荧光衍生物）。该衍生物在荧光检测器上具有较强的、特异性的响应值，使用带有荧光检测器的高效液相色谱测定其吸收峰，激发波长346 nm，发射波长422 nm，与氨苄西林标准系列比较，测定残留量。表明该方法可靠。

3.2 由标准曲线得出，HPLC法测定生鲜乳中氨苄西林含量在1～50 μg/L范围呈良好线性关系，回归方程相关系数R=0.99987，色谱峰具有良好响应值，峰周围无基质峰干扰，色谱峰理论板数为15200。以3 倍信噪比计算求得仪器检出限（LOD）为1 μg/L，以10 倍信噪比计算求得定量限（LOQ）为2 μg/L。表明该方法可信。

3.3 从加标回收试验结果看，表1表明，氨苄西林4 μg/L阳性添加时，平均回收率为76.5%（n=15），回收率范围为70.6%～85.8%，3 次考察批内变异系数分别为4.8%、5.5%、5.9%，批间变异系数为2.4%。表2表明，10 μg/L阳性添加氨苄西林平均回收率为76.8%（n=15），回收率范围为72.8%～83.9%，3 次考察批内变系数为2.6%、2.1%、6.7%，批间变异系数为2.2%。2 个阳性添加样品平均回收率差异不显著，批间变异系数较低。表明稳定性良好。

3.4 使用相同色谱条件，待测液现配，分别室温放置12、24、36 h。表3表明，液相色谱峰面积变化不显著，说明批量处理样品，在36 h内完成检测，对测定结果不会造成较大影响。表明测定重复性良好。

3.5 使用（4.6×150）mm的色谱柱，保留时间为6.1 min，较（4.6×250）mm色谱柱保留时间提前了3 min，峰面积和峰高相应增加，回收率提高2 个百分点，但使用（4.6×150）mm 色谱柱明显有一拖尾基质峰干扰。故选择使用（4.6×250）mm色谱柱更可靠。

3.6 值得提出的是，并非所有样品都有空白值，空白试样出现吸收峰时，添加经衍生化的已知标准品进行峰面积叠加确证，空白试样测定结果低于0.5 μg/L以下，可以忽略不计。进行氨苄西林残留检测时，尽量选择无吸收峰的空白试样。试样除脂或沉淀蛋白不彻底，会影响衍生化，降低回收率，因此，检测时剧烈漩涡是必要的。衍生化过程中，务必使用加盖能密封的容器，以防止挥发；终体积力求准确，使用刻度离心管定容务必校准后使用，建议定量加入为妥。

3.7 本方法测定生鲜乳中的氨苄西林残留，检测条件稳定，加标回收率较高，变异系数较小，重复性好，可操作性强，应用简单方便。对质检部门开展生鲜乳中兽药残留检验工作具有现实指导意义。

[1] NY/T 829—2004. 牛奶中氨苄青霉素残留检测方法-HPLC法.

[2] 罗道栩，邓国东，肖田安，等. 牛奶中氨苄青霉素残留检测方法研究. 中国兽药杂志，2002，36（12）：21-23.

[3] 孟欢欢，陈玎玎，祁克宗. 高效毛细管电泳检测牛奶中氨苄青霉素和阿莫西林残留方法的建立.动物医学进展，2008，29（1）：32-25.

[4] 付少刚，刘维华主编. 生鲜乳检验监管指南. 银川：阳光出版社，2010.