巨桉金属耐受蛋白EgMTP6的分子特征及功能*

韩丽娜 谢贤安 陈 辉 唐 明

(岭南现代农业科学与技术广东省实验室 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室华南农业大学林学与风景园林学院 广州 510642)

锌(Zn)作为生物的必需元素，是大量酶和调节蛋白中的催化或结构辅助因子(Maret, 2009)。但锌过量积累不仅造成植物中毒，生长受抑制(Barceletal., 1990)，还可导致植株根部缺乏磷营养(Dingetal., 2021)。为了维持体内锌平衡，植物在细胞水平上构建了包括吸收、外排、螯合、转运和储存锌的网络，如阳离子扩散辅助蛋白家族(cation diffusion facilitator, CDF)，根据结构特异性和转运底物的种类，分为Zn-CDF、Zn/Fe-CDF和Mn-CDF 3个二价金属转运蛋白类群(Montaninietal., 2007)。植物CDF又称为金属耐受蛋白(metal tolerance protein, MTP)，基于拟南芥(Arabidopsisthaliana)12个MTP基因的分类，植物MTP分为7个组(Gustinetal., 2011)。

MTP作为膜转运蛋白可将重金属离子转运到细胞器储存或外排至胞外，从而影响植物对重金属的耐受性(Gustinetal., 2011)。拟南芥中AtMTP1突变后对锌敏感(Kobaeetal., 2004)，过表达AtMTP3增强植株对锌的耐受性(Arrivaultetal., 2006)，过表达水稻(Oryzasativa)OsMTP1的酵母对锌的耐受性增强(Yuanetal., 2012)。不同重金属处理时，香橙(Citrussinensis)部分MTP表达量发生变化(Fuetal., 2017)。在不同组织和不同生长时期，葡萄(Vitisvinifera)MTP差异表达(Shirazietal., 2019)。MTP在草本植物中的功能已有大量研究，但在木本植物中的功能研究较少。

巨桉(Eucalyptusgrandis)生长快速，适应性强，为纸浆和硬木的生产提供原材料(Myburgetal., 2014)。此外，桉树可以吸收土壤中的重金属，降低自然排水系统中的重金属含量，减少矿山土壤的重金属污染(Maitietal., 2017)。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)与植物共生能够缓解重金属对宿主的毒害，香樟(Cinnamomumcamphora)接种幼套近明球囊霉(Claroideoglomusetunicatum)缓解铝胁迫(闫明等， 2007)，刺槐(Robiniapseudoacacia)与摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)共生铅耐受指数显著提高(Huangetal., 2019)，紫穗槐(Amorphafruticosa)与摩西斗管囊霉共生过程中检测到与重金属结合的膜联蛋白和金属硫蛋白，这些蛋白有效地减轻重金属对植物的毒害(宋福强等， 2014)。

桉树是典型的菌根树种，接种摩西斗管囊霉的桉树苗生物量增加，Cu和Zn的含量显著性降低，细胞壁对铅的滞留和液泡对铅的隔离作用增强(廖妤婕等， 2014)。本研究筛选到一个巨桉金属耐受蛋白，命名为EgMTP6，对其生物信息学特征、亚细胞定位、锌转运功能和表达模式进行分析，研究其在缓解锌胁迫中的作用，为进一步揭示磷、AMF与EgMTP6相互作用响应锌胁迫的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试微生物 1) 根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101化学感受态细胞，购于上海唯地生物技术有限公司。2) 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)野生型BY4741和锌转运蛋白突变体zrc1Δ，购于欧洲酵母突变体库。3) 异形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)DAOM 197198孢子悬液，由华中农业大学安建勇博士(购于法国阿格瑞植物营养公司Agronutrition，Toulouse)惠赠。孢子悬液以白车轴草(Trifoliumrepens)为宿主富集培养3个月(唐明等， 2019)，将含有白车轴草根系、根外菌丝和孢子的混合物作为菌剂，孢子密度为15 个·mL-1，侵染率为63.3%。

1.1.2 供试植物 巨桉种子购于广州汇森林业有限公司。2% NaClO灭菌16 min，无菌水清洗5次； 置于1/4 MS(Murashige-Skoog)培养基上，25 ℃暗培养3天，种子萌发后移至培养室培养14天； 将生长状态一致的巨桉幼苗移至装有白沙(121 ℃灭菌2 h)的花盆(80 mm × 80 mm × 80 mm，121 ℃灭菌20 min)中培养14天，每天浇25 mL含300 μmol·L-1NaH2PO4的Long-Ashton营养液(Hewitt, 1966)。培养室培养条件为： 16 h光照/8 h黑暗，光强度5 000 lx，温度25 ℃，湿度60%。

1.2 试验方法

1.2.1 不同锌浓度和不同磷浓度分别处理巨桉实生苗 选取生长状态一致的巨桉幼苗，分别用含ZnSO4(5、50、500 μmol·L-1)(Fuetal., 2017)，NaH2PO4(30、300、3 000 μmol·L-1)(Fanetal., 2020)的Long-Ashton营养液(Hewitt, 1966)处理，每个处理5 株，培养42天后，取根部鲜样于液氮中速冻，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 巨桉实生苗接种异形根孢囊霉 选取生长状态一致的巨桉幼苗，接种处理组在巨桉根部附近接种15 mL菌剂； 对照组加入15 mL灭菌的菌剂，用含30 μmol·L-1NaH2PO4的Long-Ashton营养液处理(Hewitt, 1966)。取样方法同1.2.1。

1.2.3 巨桉根系异形根孢囊霉定殖情况 接种异形根孢囊霉的巨桉根系，参照Xie等(2016)方法使用荧光麦胚凝集素488对菌根样品染色。荧光显微镜观察异形根孢囊霉的定殖情况，统计定殖率和丛枝丰度(Trouvelotetal., 1986)。

1.2.4 基因克隆 称取1 g巨桉根部冷冻样品，提取总RNA(Perottoetal., 2014)。反转录采用HiScriptIII第一链cDNA合成试剂盒(+gDNA wiper，Vazyme，南京)，EgMTP6片段扩增使用Phanta高保真聚合酶(Vazyme，南京)，具体流程参照说明书，扩增引物如表1。

1.2.5 生物信息学分析 ExPASy分析基因序列特征，SACS HMMTOP预测蛋白跨膜结构，SWISS-MODEL预测蛋白3D模型，MEGA11.0构建系统进化树，GENEDOC进行氨基酸序列比对。

1.2.6 烟草叶表皮亚细胞定位 农杆菌介导的本氏烟(Nicotianatabacum)叶表皮亚细胞定位和检测方法参照Pan等(2016)。表达载体为含有绿色荧光蛋白的pCanG-N(35 S∷eGFP)，内质网标记基因(HEDL∷mCherry)作为对照，片段合成引物如表1，激光共聚焦显微镜观察绿色荧光和红色荧光。

1.2.7 酿酒酵母中异源表达 酵母突变体互补方法参照Ai等(2009)，表达载体为pFL61，片段合成引物如表1。

1.2.8 不同处理表达量分析 利用实时荧光定量PCR分别检测不同浓度锌、不同浓度磷和异形根孢囊霉对巨桉EgMTP6表达量的影响，以巨桉泛素体蛋白基因(EgUBI3)为内参(定量引物如表1)，使用荧光定量专用预混液(SYBR qPCR Master Mix，Vazyme，南京)，Bio-Rad iQ5检测EgMTP6的表达量，采用2-ΔΔCt处理结果。

表1 所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in this work

2 结果与分析

2.1 EgMTP6的序列特征

在NCBI中进行同源比对，从巨桉基因组中得到与AtMTP6(NP_182304.2)相似性为64%的蛋白序列，命名为EgMTP6。基因预测显示EgMTP6含有一个长度为1 524 bp的开放阅读框，包含12个外显子和11个内含子，编码507个氨基酸(图1A)。琼脂糖凝胶电泳检测获得克隆片段的大小(图1B)。蛋白理化性质预测结果显示，EgMTP6相对分子质量为55.39 kD，理论等电点为6.48，属于碱性蛋白。跨膜结构预测显示：EgMTP6的氨基端位于膜内侧，羧基端位于膜外侧，含有5个跨膜螺旋，在TMIII和TMIV螺旋之间是一个富含组氨酸的区域，位于TMII的HSVSD基序与连接TMV和TMIV环中的HHRAD基序是Fe/Zn-CDF特异性的基序(图1C)。3D模型预测显示:EgMTP6由2个亚铁离子外排泵(ferrous iron efflux，FieF； 模板SMTL ID： 3h90.1.A)组成。FieF的主要功能是通过膜转运Zn2+和Cd2+(Cotrimetal., 2019)，因此推测EgMTP6具有转运锌的功能。

图1 EgMTP6的基因和蛋白结构特征Fig. 1 Structure features of EgMTP6A. ATG： 起始密码子；TGA： 终止密码子；黑色方块： 外显子；灰色线条： 内含子； B. 凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小； C. HD motifs 用箭头表示；TMI-TMV： 跨膜结构域；N： 氨基端；C： 羧基端； D. 以3h90.1.A为模版构建EgMTP6的3D模型。A. ATG: Start codon; TGA: Stop codon; Black box: Exons; Gray lines: Introns; B. PCR-amplified product were gel electrophoresed; C. HD motifs were indicated by arrows; TM1-TM5： Transmembrane domain; N:-NH2; C:-COOH； D. The 3D model of EgMTP6 was constructed with 3h90.1.A as template.

2.2 EgMTP6的保守性分析

以NCBI和植物基因组数据库中的AtMTP及OsMTP(Yuetal., 2018)，高粱(Sorghumbicolor)SbMTP6(XP_021307383.1)、毛果杨(Populustrichocarpa)PtMTP6 (POPTR_0002s20980)、黄瓜(Cucumissativus)CsMTP6(APM86801.1)、葡萄VvMTP6(GSVIVG01010968001)、香橙CitMTP6(Cs5g32700.1)和EgMTP6(KCW49998.1)构建系统进化树(图2)。植物CDF家族分为3个类群： Zn-CDF、Zn/Fe-CDF和Mn-CDF。Group1、Group5和Group12组成Zn-CDF。Group6和Group7组成Zn/Fe-CDF，Group8和Group9组成Mn-CDF。EgMTP6与CitMTP6相似性最高，与AtMTP6、CsMTP6、PtMTP6、VvMTP6、CitMTP6、OsMTP6、SbMTP6均属于Group6，归为Zn/Fe-CDF类群。对MTP6的蛋白序列进行比对(图3)，发现MTP6具有较高的相似性，并且都含有FieF结构域和HD-HD基序，说明EgMTP6在进化和结构上具有保守性。

图2 EgMTP6的系统进化关系Fig. 2 Phylogenetic relationship of EgMTP6

图3 MTP6多序列比对Fig. 3 Multiple sequence alignment of MTP6FieF用黑色框表示；HD motif用红色线条表示。 The FieF was indicated by a black box; The HD motif were indicated by red line.

2.3 EgMTP6在烟草叶表皮细胞的定位

EgMTP6融合eGFP表达后注射烟草叶表皮，并与内质网标记蛋白(HEDL)进行共定位，在激光共聚焦显微镜下观察，结果见图4。对照组eGFP(35 S∷eGFP)在细胞核、细胞膜和细胞质中都可以观察到绿色荧光(图4A)，说明该定位系统在烟草叶表皮细胞中可以有效表达。融合表达EgMTP6的eGFP(35 S∷eGFP∷EgMTP6)在细胞核中不能观察到绿色荧光(图4B)，但细胞核周围的丝状放射线显示绿色荧光，部分细胞膜呈不连续绿色荧光，这些是蛋白定位内质网的特征(Panetal., 2016)，并且绿色荧光在与内质网标记蛋白的红色荧光(HEDL∷mCherry)完全重合，说明EgMTP6定位于烟草叶表皮细胞的内质网。

图4 EgMTP6的亚细胞定位Fig. 4 Subcellular localization of EgMTP6A. 35S∷eGFP的荧光信号； B. EgMTP6与内质网标记蛋白(HEDL∷mCherry)共定位的荧光信号； GFP：绿色荧光通道； BF：明场； GFP+BF：绿色荧光通道与明场叠加； mCherry：红色荧光通道； GFP+mCherry：绿色荧光通道与红色荧光通道叠加. 标尺，50 μm。A. the green fluorescence protein of 35S∷eGFP。 B. fluorescence of co-transfering with endoplasmic reticulum marker (HEDL∷mCherry) of EgMTP6; GFP: Green fluorescence protein channe; BF: Bright field; GFP+BF: Green fluorescence protein channel overlapped with bright field; mCherry: Red fluorescence protein channel; GFP+mCherry: Green fluorescence protein channel overlapped with red fluorescence protein channel. Bar: 50 μm.

2.4 EgMTP6在酿酒酵母中的表达

zrc1Δ是酿酒酵母BY4741缺失液泡膜锌转运蛋白的突变体，可以将锌转运至液泡中储存(Lietal., 1998)，在BY4741和zrc1Δ中表达EgMTP6研究其转运锌的能力。点斑试验结果显示，在不添加和分别添加10和15 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培养基上zrc1Δ和zrc1Δ-EgMTP6长势没有显著差异。但在含有20 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培养基上，BY4741长势良好，而zrc1Δ不能生长(图5)，说明Sczrc1将过量Zn2+转运至液泡中，可缓解胞质中过量Zn2+对BY4741生长的抑制。zrc1Δ-EgMTP6在含有20 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培养基上可以生长，长势弱于BY4741，但显著强于zrc1Δ，说明EgMTP6部分恢复了zrc1Δ转运锌的功能。因此，在酿酒酵母中，EgMTP6部分恢复突变体zrc1Δ的遗传缺陷，作为锌转运蛋白，可将胞质中过量的锌转运到液泡中。

图5 EgMTP6在酿酒酵母中的表达Fig. 5 Expression of EgMTP6 in S. cerevisiae

2.5 锌、磷和异形根孢囊霉对EgMTP6表达的影响

2.5.1 锌、磷对EgMTP6基因表达的影响 荧光定量PCR结果显示，不同浓度(5、50和500 μmol·L-1)ZnSO4的营养液培养巨桉时，随着锌浓度的升高，EgMTP6的表达量呈现上升趋势，但差异不显著(P< 0.05)(图6A)，说明EgMTP6的表达不受锌浓度调控。用含低浓度(30 μmol·L-1)和中等浓度(300 μmol·L-1)磷的营养液培养巨桉时，EgMTP6的表达量无显著差异； 但在高浓度(3 000 μmol·L-1)磷处理时，EgMTP6的表达量是低浓度磷处理的1.9倍，是中等浓度磷处理的2.2倍，差异显著(P< 0.05)(图6B)，说明EgMTP6的表达不受低浓度和中等浓度磷的影响，但受高浓度磷的诱导。

图6 不同浓度锌或磷处理时EgMTP6的表达Fig. 6 Expression of EgMTP6 with various levels of zinc or phosphorus concentration

2.5.2 异形根孢囊霉对EgMTP6表达的影响 对接种和未接种异形根孢囊霉的巨桉根样品染色后在荧光显微镜下观察，非菌根样品中无侵染结构，菌根样品中可观察到清晰的丛枝和根内菌丝(图7A)，侵染率为65.75%，丛枝丰度为49.2%(图7B)，表明异形根孢囊霉达到有效侵染。以组成型表达的EgUBI3为内参，检测接种异形根孢囊霉(AM)和未接种异形根孢囊霉(NM)巨桉根系中EgMTP6的表达量。在转录水平上，EgMTP6的表达量在菌根组织中与非菌根组织中相比，差异显著(P< 0.05)(图7C)，说明异形根孢囊霉侵染巨桉根系显著诱导EgMTP6的表达。

图7 异形根孢囊霉对EgMTP6表达的影响Fig. 7 Effect of AMF on EgMTP6 expressionA. 异形根孢囊霉定殖形态，a： 丛枝，ih： 根内菌丝； B. 异形根孢囊霉定殖情况，F%： 侵染率，A%： 丛枝丰度； C. 异形根孢囊霉对EgMTP6表达的影响，AM： 菌根，NM： 非菌根。A. colonization morphology of AMF, a: Arbuscules, ih: Intraradical hyphae; B. AMF colonization, F%: The frequency of colonization, A%: The abundance of arbuscule abundance; C. Effect of R. irregularis on EgMTP6 expression, AM: AMF colonized roots, NM: AMF uncolonized roots.

3 讨论

3.1 EgMTP6结构和进化的保守性

以AtMTP6序列为模版，在NCBI中检索到2条蛋白序列，相似性为99.8%，仅存在一个氨基酸差异，将与AtMTP6同源性较高的序列命名为EgMTP6。EgMTP6跨膜结构与经典的6个跨膜螺旋有所不同(Montaninietal., 2007)，这种差异可能是由于EgMTP6中HHRAD motif在跨膜螺旋外侧造成的。EgMTP6为Fe/Zn-CDF类群，可转运Zn2+、Co2+、Cd2+、Ni2+等二价金属离子(Montaninietal., 2007)。与EgMTP6位于同一分支上的AtMTP6在大肠杆菌(Escherichiacoli)中过表达，大肠肝菌在含有1 mmol·L-1ZnSO4的培养基中能正常生长，但过表达AtMTP6的大肠杆菌生长受抑制，推测AtMTP6将Zn2+转运到胞质内，造成细胞内Zn2+过量，抑制大肠杆菌生长(吴平治等， 2006)。MTP6分支上的蛋白均具有FieF结构域和HD-HD基序，细菌CDF家族的YiiP蛋白最早被称为FieF，作为膜蛋白参与转运Zn2+和Cd2+(Cotrimetal., 2019)。x射线分析大肠杆菌 YiiP蛋白，发现分别位于第二和第四的跨膜螺旋的HD motif是金属结合位点(Luetal., 2007)。EgMTP6同时具有FieF结构域和HD-HD基序，在进化关系和结构上都具有保守性，推测EgMTP6可以转运Zn2+。

3.2 EgMTP6是定位在内质网的锌转运体

植物MTP蛋白多定位于细胞的膜系统(Gustinetal., 2011)，AtMTP2位于内质网，可将胞质内过量锌转运至内质网(Sinclairetal., 2018)。磷转运蛋白AtPHO1在烟草叶表皮细胞中表达定位在高尔基体，高浓度磷处理表达AtPHO1的烟草叶片时，部分AtPHO1转移到质膜上，促进磷的外排(Arpatetal., 2012)。OsMTP11在烟草叶表皮细胞中定位在高尔基体，但在高浓度锰胁迫时，OsMTP11从高尔基体网状结构移动到质膜，通过胞吐的方式把锰转运到膜外，缓解过量锰造成的胁迫(Maetal., 2018)。植物某些转运蛋白受到生物或非生物胁迫时，在细胞内的定位发生改变以适应相应的胁迫。烟草亚细胞定位结果表明，EgMTP6定位于烟草叶表皮细胞的内质网，参与锌在胞质与内质网之间的转运。

酵母PMR1是定位在高尔基体的锰转运蛋白，负责将胞质中锰运输到高尔基体，增强酵母对锰的耐受性(Tonetal., 2002)。定位在液泡膜的OsMTP8能回补pmr1Δ，恢复pmr1Δ对锰的耐受性，表明OsMTP8是锰转运蛋白(Erogluetal.， 2016)。zrc1Δcot1Δ是酵母液泡膜锌转运蛋白双突变体，对锌敏感，位于内质网的AtMTP2能回补zrc1Δcot1Δ，恢复zrc1Δcot1Δ对锌的耐受性，表明AtMTP2作为锌转运蛋白将细胞内过量锌转运至内质网(Sinclairetal., 2018)。敲除zrc1的酵母突变体zrc1Δ对锌敏感(Lietal., 1998)，在zrc1Δ中表达EgMTP6后，zrc1Δ能在含有20 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培养基上生长，但长势弱于BY4741，表明zrc1Δ中锌转运蛋白的功能得到部分恢复，进一步证明EgMTP6是锌转运蛋白。

研究还发现，部分MTP在转录水平上不受转运底物浓度调控。AtMTP11在维持细胞内锰稳态和耐受性方面发挥重要作用，但其表达量不受锰浓度的调控(Delhaizeetal., 2007)。CsMTP5与CsMTP12以异源二聚体形式转运锌，过量锌条件下，CsMTP5的表达受到抑制，锌缺乏时，CsMTP5表达受到诱导； 而CsMTP12的表达不受锌浓度变化的影响(Migockaetal.， 2018)。EgMTP6的表达在转录水平上不受锌浓度调控，可能在转录后水平或翻译水平调控锌的转运。

3.3 磷、AMF与EgMTP6的相互关系

一些作物体内的磷和锌的积累呈负相关，锌含量随磷的施用而降低，而施锌使磷含量降低(Dingetal., 2021)。Bouain等(2014)发现随着磷浓度的增加，莴苣(Lactucasativa)根部锌浓度降低，说明植物磷含量调控对锌的吸收。因此，施加磷肥可以降低植物对锌的吸收，从而缓解过量锌对植物的毒害作用。植物不仅可以通过减少对锌的吸收降低细胞内的锌含量，还可以将锌转运到细胞器或胞外降低胞质中锌含量。EgMTP6是定位于内质网的锌转运蛋白。低浓度和中等浓度磷处理时，EgMTP6表达量无显著变化； 高浓度磷处理时，EgMTP6表达量显著增加，推测细胞内磷含量的增加，促进胞质锌到内质网的转运，降低胞质中锌含量。

AMF通过菌根途径为宿主提供90%的磷(Van der Heijdenetal., 2008)。Zhang等(2017)发现玉米(Zeamays)形成菌根后，根部出现磷积累、锌缺乏。AMF可以通过增加宿主的磷营养来调控宿主体内的锌含量。Burleigh等(2003)报道蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtZIP2具有吸收锌的功能，接种AMF时MtZIP2表达量下调，根部的锌含量降低，说明AMF抑制MtZIP2的表达，降低对锌的吸收。AMF通过增加宿主的磷营养来调控宿主锌转运相关基因的表达。接种异形根孢囊霉后，EgMTP6表达量升高，异形根孢囊霉为巨桉提供磷，促进胞质内过量锌转运至内质网。因此，在巨桉菌根中异形根孢囊霉通过为宿主提供磷，诱导EgMTP6表达，进而促进胞质中锌转运至内质网，降低胞质中锌含量，缓解高锌胁迫。

4 结论

EgMTP6属于Fe/Zn-CDF家族，编码507个氨基酸，包含12个外显子和11个内含子。蛋白氨基端位于细胞内，羧基端位于细胞外，且包含5个跨膜结构和HD-HD基序。EgMTP6是位于内质网的锌转运蛋白，但EgMTP6的表达不受锌浓度影响。高浓度磷和异形根孢囊霉诱导EgMTP6的表达。EgMTP6在分子特征和功能方面的研究将有助于进一步探讨该基因在巨桉菌根耐受重金属的分子机制。