女贞叶、茎、根及根际土壤真菌群落结构及功能群特征*

李 斌 史鸿翔 刘兰兰 杨 璞 张 欣 陈 航 冯 颖 陈晓鸣

(1.中国林业科学研究院高原林业研究所 昆明 650224； 2.西南林业大学生物多样性保护学院 昆明 650224)

早期的陆生植物通过与原始的丛枝菌根真菌(AM)建立互惠共生关系，到后期松科植物与外生菌根真菌(EcM)形成稳定的共生组合，植物与真菌共生增强了植物从土壤中获取养分的能力，促进了植物向新生态位的扩张和陆地生态系统的演化(Martinetal.， 2017)。

植物内生真菌和根际土壤真菌作为植物微生物群(microbiota)的主要组成部分，也是自然界真菌多样性的主要来源之一(Porras-Alfaroetal.， 2011)。真菌与植物共生是植物进化的主要驱动力之一，二者在长期的演化历程中形成了密切的互作关系，大量研究表明，植物相关的真菌群落在调节植物生长发育、促进植物健康中发挥着重要作用，并能赋予宿主植物在生物(病原菌、植食性昆虫)和非生物(干旱、盐碱、重金属等)胁迫下的适合度优势(Yanetal.， 2019； Trivedietal.， 2020)。此外，植物内生真菌还能合成多种次生代谢产物(如生物碱、萜类、聚酮类、醌类、甾体等)，这些天然产物具有生物细胞活性，可用于生产抗肿瘤、抗感染药物(Lietal.， 2018)。因此，植物内生真菌和根际真菌在生物肥料、生防药剂、困难和污染立地生物修复、临床药物开发等领域具有巨大的开发利用潜力。

女贞(Ligustrumlucidum)属木犀科(Oleaceae)，是一种在我国分布广泛的园林树木和药用植物(女贞子)，也是资源昆虫白蜡虫(Ericeruspela)的优良寄主植物(陈晓鸣， 2011； 刘美红等， 2020)，具有抗寒耐旱、吸滞尘埃、净化空气、吸附重金属等优良特性(程敏等， 2010； Wangetal.， 2015； Zhouetal.， 2018)，在造林绿化、环境污染生物修复和虫白蜡生产中发挥着重要作用。

我国约有8 000多种树木，每种树木都蕴藏着丰富的微生物资源。前期对红豆杉类、红树类、杨树(Populus)、银杏(Ginkgobiloba)、松科植物等少数树木微生物组的研究引起了学界对林木微生物组的广泛关注(王志伟等， 2014； 袁志林等， 2019)。近年来，随着2代和3代测序技术(Illumina、PacBio等)和生物信息学分析方法的发展和进步，基于rRNA ITS(Internal Transcribed Spacer)基因的高通量扩增子测序技术已被广泛应用于林木相关真菌多样性及群落结构的研究中(曹红雨等， 2019； 王颜波等， 2020)。当前，对女贞-真菌互作的研究主要集中于丛枝菌根真菌对女贞盐胁迫、重金属胁迫耐受性的影响(张爱娣等， 2018； 何铮， 2020)，鲜见关于女贞内生真菌、根际土壤真菌群落研究的报道。基于女贞的重要价值和植物相关真菌群落的诸多功能及其利用潜力，系统解析健康植株背景下女贞不同器官和根际土壤相关的真菌类群和群落结构，旨在为研究女贞微生态平衡维持机制和开发生防、促生和抗逆功能菌株奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

平顶山女贞人工纯林(25°04′N，102°48′E，海拔2 190 m)地处云南省昆明市东北郊，属亚热带高原山地季风气候，林区土壤为山地红壤(取样土壤pH为4.76 ± 0.01，相对湿度=25.64% ± 0.17%)， 2020年7月降雨量为282.6 mm，平均气温19.8 ℃。

1.2 样品采集与表面无菌化处理

7月，研究区域降雨充沛，女贞进入生长发育最旺盛的时期。在女贞林区内间隔30 m，标记3株5年生、无病虫害且株型相似的女贞单株[株高(2.14 ± 0.13) m，地径(8.65 ± 0.54 cm)]，分别采集叶(LE)、茎(1年生)(SE)、根(RE)和根际土壤(RS)(每株4个样本，3个重复，共12个样本)，根际土壤取根围距根表0.5～4 mm的薄层土壤(Kuzyakovetal.， 2019)，过10目(2 mm)无菌筛后干冰保存。叶、茎、根放入无菌自封袋并暂存于4 ℃冰盒内，4 h内转运至实验室，参照Cregger等(2018)的方法完成叶、茎、根的表面灭菌处理，液氮速冻，无菌超低温研磨后-80 ℃保存。经PDA培养基涂板检测表面无菌后，继续开展后续试验(谢宪等， 2020)。

1.3 样本DNA的提取与扩增测序

采用土壤、植物通用试剂盒FastDNA®SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals)于无菌条件下提取各样本DNA(Bollmann-Giolaietal.， 2020)，样本DNA经电泳检测，浓度和纯度质检合格后，使用真菌rRNA基因ITS1区扩增引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTA GAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTT CATCGATGC-3′)(Adamsetal.， 2013)进行PCR扩增，PCR采用TaKaRa rTaq DNA Polymerase， 20 μL反应体系，每样本3次重复。扩增程序如下： 95 ℃预变性3 min，35个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，然后72 ℃稳定延伸10 min，最后4 ℃保存(PCR仪： ABI GeneAmp® 9700型)。经检测合格的PCR产物，使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific，USA)进行建库，基于Illumina Miseq PE300平台完成测序。测序数据已共享至NCBI Sequence Read Archive(SRA)数据库(BioProject： PRJNA730395)。

1.4 测序数据处理及生物信息学分析

参照微生物扩增子测序数据处理分析流程(Liuetal.， 2021)，基于生物云平台(https:∥cloud.majorbio.com)(上海美吉)，Raw reads经fastp(v0.19.6)过滤质控和FLASH(v1.2.11)拼接后，使用UPARSE(v7.0.1090)将有效序列聚类为OTU(Operational taxonomic units)(聚类相似度≥97%)(Chenetal.， 2018； Magoetal.， 2011； Edgar， 2013)。使用RDP classifier(v2.11)和真菌ITS数据库UNITE(v8.0)对OTU代表序列进行分类注释(Wangetal.， 2007； Nilssonetal.， 2019)。各样本按序列数51 937抽平后，在OTU水平上，使用Mothur(v1.30.2)软件(Hollisteretal.， 2009)计算α多样性指数，并对各指数进行Student’st检验； 基于OTU表和物种分类学表，利用R(v3.3.1)工具进行数据统计和可视化，通过Venn分析、群落柱形图(门、纲水平)和群落Heatmap图(属水平)比较不同样品真菌组成情况； OTU1454和OTU1252序列经NCBI数据库BLAST比对，挑选近缘物种，并使用MEGA(v11.0)软件，采用邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树； 基于样本真菌群落间的Weighted normalized Unifrac距离，利用主坐标分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM)，评价样本差异对真菌群落结构的影响(β多样性)； 接着利用LEfSe(linear discriminant analysis effect size)软件(LDA阈值>4，多组比较策略All-against-all)确定4种样品中存在显著差异的真菌biomarkers(Segataetal.， 2011)； 最后，基于FUNGuild(v1.0)数据库(Nguyenetal.， 2016)并参照谢宪等(2020)的方法对不同样品真菌功能群进行分类和统计，采用Cytoscape绘图，Adobe Illustrator CC 2018优化后输出(仅展示预测可信度为“极可能”和“很可能”且相对丰度大于1%的真菌属)。

2 结果与分析

2.1 测序数据统计及α多样性

4种样品的12个样本ITS测序共获得757 906条原始序列，质控后共获得749 855条有效序列，序列平均长度为235 bp，LE、SE、RE和RS各样本的平均有效序列数分别为60 527、60 331、61 330和67 764条(表1)。按97%的序列相似性水平，将真菌序列归类为1 486个OTU，经注释后主要分布于4个门，10个纲，18个目，33科，38属。所有OTU中，能注释到属级水平的OTU数占OTU总数的44.75%，其相对丰度之和为81.37%。4种样品测序文库的平均覆盖率(Coverage指数)均大于99.7%，说明测序深度足够，用于样本真菌群落生物信息学分析的测序数据真实可靠。

叶、茎、根和根际土壤真菌丰富度指数(Chao1和Ace)和多样性指数(Shannon和Simpson)如表1所示(OTU水平)，RS的Chao1指数最大，为900.90，其次为SE、RE和LE，分别为283.55、191.91和142.36，RS的Chao1指数显著高于其他3组(P<0.05)，分别为SE、RE和LE的3.17、4.69和6.32倍； Ace指数与Chao1指数类似，即4种样品的真菌丰富度为RS>SE>RE>LE。此外，RS的Shannon指数为3.89，显著高于其他3组样品，而Simpson指数在4组样品间的差异不显著。由此可知，女贞叶、茎、根和根际土壤的真菌丰富度排序为根际土壤>茎>根>叶，而多样性为根际土壤>叶>茎>根。

表1 不同样品测序信息及α多样性指数①Tab.1 Sequencing information and Alpha diversity index in different samples

2.2 不同样品中的共有OTU和真菌属

4种样品中，LE、SE、RE和RS各样品真菌群落的OTU数分别为241、397、386和1 081，分别占OTU总数的16.22%、26.72%、25.97%和72.74%。对4种样品的真菌组成进行OTU Venn图分析(图1A)发现，4种样品中共有的OTU有31个，仅占OTU总数的2.08%，其相对丰度之和为38.44%。2组样品比较中，RE和RS共有的OTU数最多，为297个，其次为LE和SE、SE和RS、LE和RS，分别为158、140和95个，即叶、茎、根中39.42%、35.26%、76.94%的OTU都存在于根际土壤中； 然而，LE和RE、SE和RE共有的OTU数相对较少，分别为42和43个。

4种样品共有的OTU中，能注释到属级水平的有22个，其相对丰度之和为33.46%。这些真菌属主要包括：枝孢属(Cladosporium)、维希尼克氏酵母属(Vishniacozyma)、Saitozyma、Rachicladosporium、Symmetrospora、链格孢属(Alternaria)、青霉菌属(Penicillium)、短梗霉属(Aureobasidium)、尾孢属(Cercospora)、线黑粉酵母属(Filobasidium)、宙斯沸耳属(Dioszegia)、镰刀菌属(Fusarium)等，其中，枝孢属相对占比最高，占共有物种总数的33.62%(图1B)。

图1 4种样品真菌群落OTU韦恩图(A)和共有属(B)Fig. 1 OTUs Venn diagram (A) and common genera (B) of fungal communities of four samples图B中不同颜色表示不同的物种，面积表示该物种数目占共有物种总数的百分比。LE、SE、RE和RS分别表示叶内、茎内、根内和根际土壤，下同。Different colors in the Fig.B represented different species, and its area represented the percentage of a given species in the total number of common species. The LE, SE, RE and RS represented leaf endosphere, stem endosphere, root endosphere and rhizosphere soil respectively, the same below.

2.3 不同样品中的真菌优势类群组成分析

在门水平，女贞叶、茎、根和根际土壤样品真菌主要归属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、罗兹壶菌门(Rozellomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)(图2A)。在LE、SE、RE和RS中，子囊菌门的相对丰度分别为74.12%、72.63%、78.70%和39.25%； 担子菌门的相对丰度分别为25.35%、27.08%、19.87%和45.20%； 罗兹菌门和被孢霉门只分布于根内和根际土壤中，且相对丰度较低(图2A)。由此可见，子囊菌门和担子菌门是女贞叶、茎、根和根际土壤中的优势真菌类群。

在纲水平上(图2B)，座囊菌纲(Dothideomycetes)为LE和SE中的优势真菌纲，相对丰度分别为67.09%和70.22%，但在RE(1.8%)和RS(3.38%)中的相对丰度较低； 银耳纲(Tremellomycetes)在SE(22.78%)中的相对丰度最高，其次为RS(16.61%)、LE(14.91)和RE(1.18%)； RE中相对丰度最高的为粪壳菌纲(Sordariomycetes)(46.59%)，其次为锤舌菌纲(Leotiomycetes)(27.05%)和伞菌纲(Agaricomycetes)(11.60%)； RS中的优势真菌纲为伞菌纲(36.80%)。此外，散囊菌纲(Eurotiomycetes)在4种样品中均有分布，但在RS(11.50%)中的相对丰度最高； 囊担子菌纲(Cystobasidiomycetes)主要分布于LE(9.12%)和SE(2.48%)中； 而盘菌纲(Pezizomycetes)主要分布于RE(5.30%)和RS(5.97%)中； 古根菌纲(Archaeorhizomycetes)(7.53%)、被孢霉纲(Mortierellomycetes)(3.94%)则主要分布于RS中。

图2 4种样品中真菌在门(A)、纲(B)和属(C)水平上的相对丰度Fig. 2 The relative abundance of fungi in four samples at phylum (A), class (B) and genus (C) level在图A和图B中，“其他”表示所有相对丰度小于1%的真菌类群的总和。在图C中，色块颜色表示真菌相对丰度的对数值(lg)。In figure A and figure B, the “others” represented the sum of fungal taxa with relative abundance of less than 1%. In figure C, the colors represented the logarithms of relative abundance of fungi.

在属级水平(图2C)，4种样品丰度排名前30的物种中，LE中相对丰度较高的属有枝孢属(27.88%)、亚隔孢壳属(Didymella)(12.21%)、维希尼克氏酵母属(9.05%)、Symmetrospora(8.40%)、横断孢属(Strelitziana)(5.99%)、尾孢属(4.40%)和链格孢属(4.27%)； SE中相对丰度较高的属有枝孢属(38.01%)、维希尼克氏酵母属(15.24%)、Rachicladosporium(11.86%)、链格孢属(3.93%)、短梗霉属(Aureobasidium)(2.78%)、横断孢属(2.02%)； RE中相对丰度较高的属有Rhexodenticula(12.61%)、普可尼亚属(Pochonia)(11.12%)、梭链孢属(Fusidium)(11.09%)、树粉孢属(Oidiodendron)(10.74%)、Acidomelania(8.04%)和拟无疣革菌属(Athelopsis)(5.70%)； 而RS中相对丰度较高的属有裸盖菇属(Psilocybe)(33.59%)、Saitozyma(15.92%)、青霉菌属(Penicillium)(6.35%)、努氏盘菌属(Ruhlandiella)(5.88%)、古根菌属(Archaeorhizomyces)(4.56%)和被孢霉属(Mortierella)(3.94%)。由此可见，枝孢属、维希尼克氏酵母属、亚隔孢壳属、Rachicladosporium、Symmetrospora、链格孢属主要分布于叶和茎中，而裸盖菇属、Saitozyma、树粉孢属、Rhexodenticula、梭链孢属、普可尼亚属、努氏盘菌属、Acidomelania、青霉菌属等主要分布于根和根际土壤中。此外，样本聚类分析显示(图2C)，LE和SE聚为一支，RE和RS聚为一支，表明在属水平上，女贞叶和茎，根和根际土壤的真菌群落结构较为相似。

2.4 枝孢属真菌OTU系统发育分析

OTU1454和OTU1252在叶、茎、根及根际土壤样品中的序列总数分别为106 263和11 696，且注释为枝孢属。系统发育分析表明(图3)，OTU1454与Cladosporiumsp.和枝状枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)的亲缘关系较近，而OTU1252与Cladosporiumlangeronii，Cladosporiumpsychrotolerans，Cladosporiumneolangeronii的亲缘关系较近。

图3 基于rDNA ITS1序列构建OTU1454和OTU1252的系统发育树(Neighbor-joining算法)Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic trees based on rDNA ITS1 sequences of OTU1454 and OTU1252

2.5 β多样性分析

基于OTU水平，对4种样品的12个样本进行PCoA分析，比较不同样本真菌群落结构的相似性和差异性(图4)，结果显示，PC1轴和PC2轴的贡献率分别为55.5%和24.04%，累积贡献率为79.54%； 并且LE与SE样本点间的距离较为接近，二者与RE和RS的距离相对较远，表明女贞地上部分叶和茎内生真菌的群落结构较为相似，而与地下部分根和根际土壤真菌的群落结构存在差异。

图4 不同样本真菌群落主坐标分析Fig. 4 PCoA of fungal communities in different samples

此外，通过非参数检验方法-相似性分析(ANOSIM)评估不同样品真菌群落结构在组间及组内的差异水平(表中，R值越大，P值越小，表明组间差异越显著)。由表2可见，4组样品LE vs SE vs RE vs RS的ANOSIM分析结果中，R值为0.898 1，且P值为0.001，表明4种样品真菌群落结构的组间差异显著大于组内差异，3组比较的结果与之类似。然而，在两两比较分析中，除了LE vs SE和RE vs RS的R值分别为0.777 8和0.814 8外，其余均为1，且P> 0.05，表明两两样品间的组间差异大于组内差异，但不显著，且LE和SE、RE和RS间的真菌群落组成差异相对较小，这与PcoA分析的结果相一致。

2.6 不同样品LEfSe物种差异判别分析

由以上分析可知，女贞叶、茎、根和根际土壤为微生物群落提供了不同的栖息地，进而导致不同的群落结构(beta多样性)差异。基于LEfSe分析可寻找女贞4组样品真菌群落中具有统计学差异的物种，并识别叶、茎、根和根际土壤中的生物标记物(biomarker)(图5)。由分析结果可知，女贞4种生态位真菌群落在门水平上无显著差异。在纲水平上，囊担子菌纲显著富集于叶中，座囊菌纲显著富集于茎中，锤舌菌纲和粪壳菌纲显著富集于根内，伞菌纲显著富集于根际土壤中。在属水平上，叶中的biomarker为Symmetrospora、线黑粉酵母属、尾孢属、亚隔孢壳属和横断孢属； 茎中的biomarker为枝孢属、维希尼克氏酵母属、Rachicladosporium和短梗霉属； 根中的biomarker为枝芽瓶霉属(Cladophialophora)和镰刀菌属； 根际土壤中的biomarker为Saitozyma、拟盘多毛孢属和青霉菌属。

图5 不同样品LEfSe差异物种分析Fig. 5 LEfSe analysis of differential species in different samples图中红、蓝、绿和紫色的节点分别表示在LE、SE、RE和RS中显著富集，且对组间差异存在显著影响的真菌类群，黄色节点表示在不同分组中无显著差异或对组间差异无显著影响的真菌类群； 图中C、O、F和G分别表示纲、目、科和属。The red, blue, green and purple nodes in the figure represented fungal taxa that were significantly enriched in LE, SE, RE and RS respectively, and significantly influenced the differences between groups at the same time. The yellow nodes represented fungal taxa that have no significant differences among different groups, or that had no significant effect on the differences between groups. The C, O, F and G represented class, order, family and genus, respectively.

2.7 不同样品真菌功能群比较分析

基于FUNGuild的功能预测结果表明(图6)，共生营养型真菌在RE和RS中占比相对较高，分别为25.07%和10.91%，主要包括杜鹃花类菌根真菌(树粉孢属)、外生菌根真菌(努氏盘菌属)和内生真菌(Acidomelania)； 腐生营养型真菌则主要分布于RE(34.98%)和RS(56.60%)中，主要由未定义腐生真菌(裸盖菇属、梭链孢属、拟无疣革菌属、青霉菌属)和土壤腐生真菌(古根菌属)组成； 病理营养型在RE(15.76%)中的相对丰度最高(主要为动物病原菌普可尼亚属)，其次为LE(6.87%)(主要为植物病原菌横断孢属)。此外，LE与SE中病理-腐生营养型、病理-腐生-共生营养型真菌的相对丰度较高，病理-腐生营养型真菌主要有亚隔孢壳属、尾孢属； 病理-腐生-共生营养型真菌主要包括枝孢属、维希尼克氏酵母属、Rachicladosporium等。由此可见，女贞不同器官和根际真菌功能群分类呈现地上和地下部分分化的特征，叶和茎中的真菌以复合营养型(病理-腐生-共生营养型、病理-腐生营养型)真菌为主，分别占叶和茎真菌功能群的76.97%和91.68%； 然而，女贞根和根际土壤中的真菌以单一营养型(腐生营养型、共生营养型)为主，分别占60.05%和67.51%(图6)。

图6 叶、茎、根、根际土壤真菌功能群组成及网络分布Fig. 6 Functional group composition and network of fungi in leaf, stem, root and rhizosphere soil不同颜色代表不同的真菌营养型或Guilds，扇形面积表示不同营养型在各样品中的相对丰度，节点大小表示某一真菌属在所有样品中的绝对丰度，节点与样品连线的粗细表示该真菌属在对应样品中的相对丰度。Different colors represent different fungal trophic types or Guilds, the pie diagram area indicates the relative abundance of different trophic types in each sample, the size of nodes indicates the absolute abundance of a genus in all samples, the thickness of links indicates the relative abundance of the genera.

3 讨论

3.1 女贞叶、茎、根、根际土壤真菌多样性和物种组成

植物相关微生物群的遗传、生态、功能及分类多样性与植物生长和土壤健康密切相关(Saleemetal.， 2019)，生态漂变、选择、进化和扩散作用可影响植物微生物群的组成和多样性(Fitzpatricketal.， 2020)。本研究发现，女贞根际土壤真菌多样性显著高于叶、茎和根，这与美洲黑杨(Populusdeltoides)(Creggeretal.， 2018)、葡萄(Vitisvinifera)(Zarraonaindiaetal.， 2015)的结果相似。基于目前的研究数据表明，根际微生物群向根内过渡的过滤选择机制导致多样性降低的现象在植物中普遍存在(Fonseca-Garcíaetal.， 2016； Hassanietal.， 2019)，然而构树(Broussonetiapapyrifera)根内和根际真菌多样性无显著差异，并认为与真菌对植物内环境具有较高的耐受性相关(Chenetal.， 2020)。此外，女贞根内真菌多样性较低可能与富集较高丰度的病理营养型真菌有关，研究发现病原菌的存在会抑制菌根真菌、内生真菌的定殖，进而降低内生真菌的多样性(Creggeretal.， 2018)。女贞叶内真菌丰富度较低的原因可能是其暴露于多变严苛的环境条件下(如温度、水分、养分的昼夜波动、紫外线辐射、营养匮乏)所致(Vorholt， 2012)。

不同植物拥有其独特的微生物群落。研究发现，植物相关微生物群功能冗余特性背后存在一个“核心微生物群”(Core microbiota)，其作为植物微生物群的子集，携带对宿主健康至关重要的基因(Lemanceauetal.， 2017)。基于韦恩图分析发现，女贞核心真菌类群主要包括枝孢属、维希尼克氏酵母属、Saitozyma、Rachicladosporium、Symmetrospora、链格孢属、青霉菌属等，且丰度较高的枝孢属(OTU1454、OTU1252)真菌在不同女贞植株中的分布较均匀。系统发育分析表明OTU1454与枝状枝孢霉的亲缘关系较近，研究发现，耐盐植物碱蓬(Suaedasalsa)内生枝状枝孢霉具有林木广谱共生菌特性，可显著提高宿主的种子发芽率和促进非宿主植物北美枫香(Liquidambarstyraciflua)幼苗的生长，且可从土壤水平传播到植物地上部分(Qinetal.， 2016)。此外，OTU1252与C.langeronii的亲缘关系较近，且有研究发现C.langeronii可使白蜡虫感病致死(Sunetal.， 2018)。此外，女贞叶与茎内枝孢属、链格孢属、亚隔孢壳属真菌的相对丰度较高，已有研究表明，这些植物内生真菌的次生代谢产物具有抗肿瘤细胞活性(Lietal.， 2018；Ariantarietal.， 2020)和抗菌活性(Sunetal.， 2013；Mousaetal.， 2015)，这些真菌的存在可能与女贞的药用价值有关(陈安徽等，2014)。

Beta多样性分析表明，女贞不同叶、茎根和根际土的真菌群落结构存在显著差异，同一器官菌群结构在不同植株间差异较小，表明植物区室(Plant compartment)特性是影响女贞真菌群落生态位分化的主要驱动因子，这种微生物群落组成的“植物区室特异性”(Plant compartment-specific)在植物中普遍存在(Coleman-Derretal.， 2015； Chenetal.， 2020)。然而，有研究发现土壤微生物是植物内生菌的主要来源之一(Vandenkoornhuyseetal.， 2015)，本研究中，叶、茎、根内39.42%、35.26%、76.94%的OTU都存在于根际土壤中，表明土壤真菌可能是植物内生真菌的主要来源之一，且女贞叶、茎、根和根际土真菌群落结构存在部分重叠。此外，相比较而言，叶与茎的真菌群落结构较为相似，二者不仅通过气孔、皮孔与相同的外部环境相关联，而且还通过内部输导组织相连通，研究表明，植物地上组织中的内生真菌可通过孢子或菌丝裂殖等方式进行水平传播(Rodriguezetal.， 2009； Yanetal.， 2019)。值得注意的是，宿主(基因型、形态特征、免疫反应、根系分泌物等)和环境因子(生物和非生物胁迫、栽培管理、多界相互作用等)的改变可驱动植物相关微生物群的重新组装(Trivedietal.， 2020)。因此，女贞不同器官和根际土的真菌群落结构和多样性在不同地理区域、不同季节、不同发育阶段内的时空动态还有待进一步研究。

3.2 女贞叶、茎、根、根际土壤真菌生态功能特征

植物相关真菌在植物中发挥着有利、中性或有害的作用(Trivedietal.， 2020)。本研究中，女贞不同部位真菌功能群分类呈现地上和地下部分分化的特征，叶和茎中的真菌以复合营养型(病理-腐生营养型、病理-腐生-共生营养型)真菌为主，而根和根际土壤真菌以单一营养型(共生营养型、腐生营养型)为主。研究发现，植物地下微生物主要在促进养分获取(矿质营养的同化、溶解、转运等)中发挥作用，而地上部分微生物则在提高植物抗逆性(抗病虫害、抗干旱、霜冻等)方面发挥作用(Yanetal.， 2019； Trivedietal.， 2020)。本研究中，女贞生长在降水充沛的酸性土壤条件下，淋溶作用强，其通过在根部富集高丰度的腐生、共生营养型真菌，可促进女贞对矿质营养的活化、吸收和利用(Philippotetal.， 2013)，满足自身生长发育的养分需求。此外，叶与茎内复合营养型真菌(枝孢属、维希尼克氏酵母属、链格孢属、亚隔孢壳属)丰度较高，研究发现，植物内生真菌的生活方式具有可塑性，在宿主生理、遗传因素、真菌病毒及环境条件等影响下会发生偏利共生、互惠共生和寄生间的角色转变(袁志林等， 2008； Zhouetal.， 2021)，健康女贞中共存多种营养型真菌，进一步支持了植物“共生功能体”(holobiont)和谐共生的拮抗平衡假说(Schulzetal.， 1999； Vandenkoornhuyseetal.， 2015)。

4 结论

女贞不同营养器官(叶、茎、根)和根际土壤中存在多种药用、促生及抗逆真菌资源，4种样品中共获得1 486个OTU，注释后主要分布于4个门，10个纲，18个目，33科和38属。叶、茎、根和根际土真菌多样性、群落结构及功能群特征存在相似性和差异性，根际土壤的真菌多样性显著高于叶、茎和根，叶与茎的群落结构和物种组成较为相似，与根和根际土壤差异较大。在门水平上，叶、茎、根和根际土的优势真菌均为子囊菌门和担子菌门； 在属级水平上，叶、茎内生真菌的优势属为枝孢属和维希尼克氏酵母属，根内优势属为Rhexodenticula和普可尼亚属，根际土壤的优势属为裸盖菇属和Saitozyma。叶、茎、根及根际土壤共有的真菌主要包括枝孢属、维希尼克氏酵母属、Saitozyma、Rachicladosporium、Symmetrospora、链格孢属及青霉菌属。不同部位真菌功能群分类呈现地上和地下部分分化的特征，叶和茎中复合营养型(病理-腐生-共生营养型、病理-腐生营养型)真菌相对丰度较高，而根和根际土壤中单一营养型(共生营养型、腐生营养型)真菌占比较高。