沙棘转录因子HrWRKY53基因分离及其参与抵御绕实蝇的作用分析*

姚 莹 曹金峰 陆世曈 丁文彬 张一文 魏建荣 刘建凤

(1.河北大学生命科学学院 河北大学生命科学与绿色发展研究院 保定 071002； 2.河北省农作物耐盐碱评价与遗传改良重点实验室 沧州市农林科学院 沧州 061001)

沙棘(Hippophaerhamnoides)果实味酸，又称醋柳、酸刺，属胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)，是1种落叶性灌木或小乔木，广泛分布于亚欧大陆的温带、寒温带地区以及亚热带高山区，北美地区也有引种栽培(Tengetal.， 2006)。我国的沙棘植物资源十分丰富，遍及西南、西北、华北和东北等区域，其已成为我国“三北”地区造林绿化与经济的主要树种之一，种植面积较大，但虫害严重威胁着沙棘种植与推广。目前，沙棘害虫有多种，涵盖了鳞翅目、鞘翅目、半翅目和双翅目等多种食叶与食果昆虫。其中，双翅目中沙棘绕实蝇(Rhagoletisbatavaobseuriosa)(RBO)是危害沙棘果实的首要害虫(Shamanskayaetal.， 2011)。迄今为止，该科已发现约500属、4 500余种，其中有害实蝇种类占35%左右，广泛分布于世界各地(汪兴鉴， 1995)。沙棘绕实蝇成虫产卵于果皮下，幼虫蛀食果肉，常致受害果实干瘪，是国家林业和草原局发布的国内检疫害虫之一(魏建荣等， 2012)。1985年在国内辽宁省建平县首次发现沙棘绕实蝇的危害现象，其果实受害率达80%以上(葛葆蔚等， 1988)。近年来在内蒙古乌兰布和沙漠地区和新疆阿勒泰地区的沙棘林中也出现沙棘绕实蝇，且危害严重，说明该虫害有扩大趋势。目前，种植沙棘地区对绕实蝇危害的防治主要是依靠喷施化学农药，该方法可有效的降低害虫存活率及其繁殖率，但会出现环境污染等生态问题，不利于可持续性发展。因此，开发环保、高效、可持续发展的防治方式是目前沙棘产业的待解决问题，也是重要的研究方向之一。

WRKY转录因子家族部分成员可通过参与茉莉酸(Jasmonic acid，JA)、水杨酸(Salicylic acid，SA)和油菜素内酯(Brassinolide，BR)等信号途径来提高植株的抗病虫能力(Stametal.， 2014)。如水稻OsWRKY24/70/53/45基因通过影响乙烯信号途径来参与调控抗褐飞虱(Nilaparvatalugens)反应(Luetal.， 2014； Zhangetal.， 2015； Huetal.， 2015)； 棉花(Gossypiumspp.)WRKY40基因可以通过调控MPK-WRKY-茉莉酸信号通路，来提高植株对白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)的抗性(Lietal.， 2016)； 对大豆(Glycinemax)WRKY基因家族鉴定与分析时发现其部分成员受SA信号通路诱导后提高了植株抗大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines)的能力(Yangetal.， 2017)；AtWRKY40转录因子可通过与下游靶基因DWF4基因上游调控元件结合，进而调控BR合成参与抗虫过程(Chenetal.， 2017)； Hou等(2019)鉴定和证实了WRKY转录因子家族成员WRKY72直接与JA合成关键基因AOS1启动子中的W-box顺式元件结合，增强AOS1的DNA甲基化水平并抑制其转录，引起植株内源性JA水平的下降，最终造成植株对白叶枯病易感。由此可见，WRKY家族成员通过激活相关信号途径广泛参与植株抗病虫的应答反应。

综上，有关WRKY转录因子抗虫分子生物学研究多集中在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、棉花和大豆等模式植物和经济作物中，而在其他植物尤其是在木本植物中鲜见报道。鉴于此，本研究基于绕实蝇危害前后的沙棘果实转录组数据，获得48个沙棘HrWRKY基因家族成员(Wangetal.， 2019)，其中部分成员参与了绕实蝇危害的应激反应，尤其是HrWRKY53转录因子在受到绕实蝇危害及JA激素诱导后表达极为显著，本研究结果为进一步明确沙棘HrWRKY53转录因子的生物学功能及介导JA激素信号通路参与抗虫的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 沙棘植株获取

2～3年生沙棘扦插苗取材于河北大学实验基地。该基地沙棘原始植株取自于中国林业科学研究院沙漠林业实验中心(内蒙古磴口县)(40°25.935′N，106°43.442′E)，由蒙古沙棘的实生无性系乌兰格木(Hippophaerhamnoidessubsp.mongolica)(母本)与中国沙棘(Hippophaerhamnoidessubsp.sinensis)(父本)杂交获得的F2代无性系材料。

1.2 沙棘HrWRKY53转录因子克隆及生物信息学分析

沙棘转录组数据： 基于绕实蝇危害前后沙棘果实转录组数据(PRJNA507906)，分析抗、感沙棘植株体内WRKYs和JA信号通路上关键基因的序列特征及表达情况。

HrWRKY53转录因子克隆： 初步获得HrWRKY53基因ORF电子全长序列1 301 bp。利用Trizol法提取沙棘幼苗叶片总RNA，利用TaKaRa 610A反转录试剂盒合成cDNA。PCR反应体系为： cDNA模板1 μL，DNA聚合酶0.1 μL，10×Buffer 1.0 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.8 μL，10 mmol·L-1的基因特异性引物F与R各0.5 μL(F： GCAACAGCAGA TGAAACACC； R： CCTAGGATATTGCCCTTGACC)，ddH2O补至10 μL体系。PCR反应程序为： 95 ℃变性5 min、95 ℃变性30 s、58 ℃退火45 s、72 ℃延伸1.5 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果，利用TaKaRa胶回收试剂盒(Code No.9762)纯化回收目的条带； 将回收的目的片段与TaKaRa pGM-T Vector连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，PCR鉴定的阳性克隆进行测序。

HrWRKY53转录因子生物信息学分析： 使用SOPMA分析蛋白的二级结构； 使用ProtScale(http:∥web.expasy.org/protscale)预测蛋白的亲疏水性； 使用NetPhos2.0 Server(http:∥www.cbs.dtu. dk/services/NetPhos-2.0/)预测蛋白的磷酸化位点； 通过NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中BLASTP搜索与该基因同源性较高的序列，并利用MEGAX中邻近法构建进化树，bootstrap值设置为1 000； 利用DNAMANV6进行多重序列比对。

1.3 沙棘HrWRKY53的组织表达模式分析

为了研究HrWRKY53的组织表达模式，选取沙棘植株的根、茎、叶片和果实等组织，利用宝生物工程(大连)有限公司的植物总RNA提取试剂盒RNAiso Kit(D326 S)提取上述样品沙棘果实的总RNA，并采用UEIris II RT-PCR system for First-Strand cDNA Synthesis(with dsDNase)试剂盒(R2028，US EverbrightInc.)，以总RNA为模板反转录合成cDNA。以沙棘泛素基因(HrUbi)为内参基因，使用荧光定量PCR试剂盒2×Fast Super EvaGreen®qPCR Master Mix进行HrWRKYs的基因表达量分析，引物序列信息如表1。qRT-PCR反应程序为： 95 ℃预变性5 min； (94 ℃ 20 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)×35循环，95→65 ℃熔解曲线(0.1 ℃·s-1)。各组织3次生物学重复，使用相对定量法2-ΔΔCt进行数据分析，采用独立样本t检验方法比较目的基因在敏感系植株和抗虫系植株的表达差异。

表1 沙棘HrWRKY53及JA合成途径中关键基因荧光定量引物序列Tab.1 The fluorescent quantitative primer for genes

1.4 绕实蝇危害及激素诱导后HrWRKY53基因表达分析

采用枝条罩笼接虫法对沙棘植株果实进行RBO处理，分别选取沙棘成果期植株3株，并分别在其上各选取3个2年生且直径约0.5 cm粗的幼嫩结果的枝条，对其进行疏果处理，确保果实数量、形态和大小基本一致。利用养虫笼(50 cm×50 cm×100 cm)分别对上述枝条进行罩笼(尽量使RBO接触果实)，各引入30头待产卵沙棘绕实蝇雌成虫让其产卵危害，并分别在罩笼0、2、7、14、21天采取受害果实，立即浸入液氮，用于HrWRKY53基因的荧光定量表达。

对株高约1.2～1.5 m的沙棘植株的果实分别喷施0.1 mmol·L-1MeJA、0.1 mmol·L-1ABA和0.1 mmol·L-1ETH，并选取处理0、4、8、16和36 h的植株地上部10、70和140 cm各3片叶片混合，液氮冷冻后-80 ℃保存。各时间点3次生物学重复，使用相对定量法2-ΔΔCt进行数据分析，采用独立样本t检验方法比较目的基因在敏感系植株和抗虫系植株的表达差异。

上述样品的RNA提取与荧光定量PCR均参照1.3描述的方法。

1.5 统计学分析

试验数据均采用Origen 7.5软件进行统计分析，差异显著性比较采用t检验法。

2 结果与分析

2.1 基于转录数据筛选参与沙棘抗绕实蝇的HrWRKYs转录因子家族成员

通过绕实蝇危害前后转录组数据分析，获得8个差异表达的HrWRKYs基因成员HrWRKY1/17/18/53/33/40/41/71，其中，HrWRKY53的表达水平在抗、感之间表现显著性差异(表2)。鉴于此，对转录因子HrWRKY53开展了后续分子生物学功能验证。

表2 沙棘关键HrWRKYs差异基因的转录组数据表达量分析Tab.2 Transcriptome data analysis of key HrWRKYs differential genes in sea-buckthorn

2.2 沙棘HrWRKY53生物信息学分析

提取沙棘幼苗叶片RNA，并利用RT-PCR获得与预期ORF框大小一致的长为1 302 bp的HrWRKY53基因，编码433个氨基酸残基，预测蛋白分子量49.26 kD，等电点5.55。SOPMA预测表明，HrWRKY53蛋白的二级结构α螺旋(alpha helix)包含38个氨基酸残基，占8.78%； 延伸链(extened strand)的氨基酸残基有41个，占9.47%； β-转角(beta turn)包含10个氨基酸残基，占2.31%； 无规则卷曲(Random coil)包含433个氨基酸残基，占79.45%(图1A)，推测该蛋白的功能域主要由无规则卷曲构成。HrWRKY53蛋白含高于0.5阈值的有141个磷酸化位点(图1B)，可能与磷酸化调控有密切关系。亲疏水性分析显示，疏水蛋白所占比例较大，属于疏水蛋白(图1C)。

图1 HrWRKY53编码蛋白的生物信息学分析Fig. 1 Bioinformatic analysis of HrWRKY53A、B、C分别是二级结构预测、磷酸化位点预测和亲疏水性分析(正峰代表疏水性，负峰代表亲水性)。 A, B and C are the secondary structure prediction, phosphorylation site prediction and hydrophobicity analysis (positive peak value represents hydrophobicity, negative peak value represents hydrophilicity).

2.3 沙棘HrWRKY53同源比对及进化分析

利用NCBI在线数据库，选取多条相似度较高物种的WRKY蛋白与沙棘HrWRKY53蛋白进行同源比对，结果显示目的蛋白有2个WRKY保守域，且锌指结构为C2H2，属于第Ⅰ类WRKY转录因子(图2A)。进一步构建系统发育树，结果显示，其与蔷薇科草莓FvWRKY25同源关系最近(图2B)。

图2 HrWRKY53转录因子蛋白同源进化分析Fig. 2 Homologous evolutionary analysis of HrWRKY53 transcription factor proteins A、B分别是HrWRKY53与其他物种WRKY蛋白序列比对分析和不同WRKY蛋白的进化树分析。方框表示WRKY结构域，星号表示锌指结构。沙棘HrWRKY53，野大豆GsWRKY24，大豆GmWRKY49，木豆CcWRKY24，大豆GmWRKY39，红小豆VaWRKY25，绿豆VrWRKY24，豇豆VuWRKY24，榴莲DzWRKY24，白栎QiWRKY24，野草莓FvWRKY25，乌草HuWRKY24，可可树TcWRYK33，麻风树JcWRYK24，月季RcWRYK24，棉花GhWRYK9，麻风树JcWRKY7，木槿HsWRKY26，莲NnWRKY24，雷公藤TwWRKY26，大桉EgWRKY26，灌木蒲桃SoWRKY26，狭叶羽扇豆LaWRKY2，鹰嘴豆CaWRKY26。A and B are sequence alignment of HrWRKY53 and WRKY proteins of other species and phylogenetic analysis of different WRKY proteins.The box indicates the WRKY domain, and the star indicates the zinc finger structure. Hippophae rhamnoides HrWRKY53, Glycine soja GsWRKY24, Glycine max GmWRKY49, Cajanus cajan CcWRKY24, Glycine max GmWRKY39, Vigna angularis VaWRKY25, Vigna radiata VrWRKY24, Vigna unguiculata VuWRKY24, Durio zibethinus DzWRKY24, Quercus lobata QiWRKY24, Fragaria vesca FvWRKY25, Herrania umbratica HuWRKY24, Theobroma cacao TcWRYK33, Jatropha curcas JcWRYK24, Rosa chinensis RcWRYK24, Gossypium hirsutum GhWRYK9, Jatropha curcas JcWRKY7, Hibiscus syriacus HsWRKY26, Nelumbo nucifera NnWRKY24, Tripterygium wilfordii TwWRKY26, Eucalyptus grandis EgWRKY26, Syzygium oleosum SoWRKY26, Lupinus angustifolius LaWRKY24, Cicer arietinum CaWRKY26.

2.4 沙棘HrWRKY53组织表达分析

利用qRT-PCR分析沙棘茎、叶和果实不同组织HrWRKY53基因的表达模式，结果发现上述组织中该基因均有表达，但在抗虫植株的各组织中表达量显著高于敏感植株，尤其在抗虫植株的果实和叶片中该基因表达量显著提高，其表达量约为敏感植株3.36倍和1.66倍(图3)。

图3 转录因子HrWRKY53在沙棘不同组织中的表达Fig. 3 Expression of transcription factor HRWRKY53 in different tissues of sea-buckthornRI： 抗虫无性系； SI： 敏感无性系； *和**： 在P<0.05和P<0.01时差异表达显著性和极显著性水平,下同。RI： Insect-resistant clones; SI： Sensitive clones * and **: Significant differences and extremely significant differences at 0.05 level and 0.01 level,the same below.

2.5 绕实蝇危害及激素诱导后沙棘HrWRKY53表达分析

qRT-PCR结果表明，该基因在沙棘植株受绕实蝇危害后表达提高，并受激素ET、MeJA和SA的诱导。在绕实蝇危害后不同时间，发现该基因无论是在抗性植株还是感性植株中表达量均呈上升趋势，尤其抗性植株中其表达量较感性植株提高了0.2～1.4倍(图4A)； SA处理16 h内，基因的表达变化趋势不明显，但处理36 h时抗性植株内基因表达量急剧上升，较对照上升了6.14倍，且较感性植株高出了1.87倍(图4B)，随着MeJA和ET处理时间的延长，该基因的表达量也呈上升趋势，在36 h达到最高峰，尤其是MeJA诱导后，该基因在抗性植株较对照植株表达提高了43.8倍，且较感性植株高出了1.63倍(图4C和图4D)。

图4 不同处理下HrWRKY53的表达模式Fig. 4 Expression patterns of HrWRKY53 under different treatments A、B、C、D分别为RBO、SA、JA和ET胁迫下HrWRKY53基因的表达模式分析。A, B, C and D are the expression patterns of HrWRKY53 gene under RBO, SA, JA and ET stress.

2.6 明确了沙棘植株体内JA激素合成相关的关键基因的表达变化

JA合成途径中关键基因HrJA2、HrSpr2、HrLOX1、HrLOX2、HrAOS和HrAOC在抗、感植株体内及绕实蝇危害前后植株体内均有一定变化，其中HrJA2、HrLOX1、HrAOS和HrAOC4个基因在绕实蝇危害抗性植株前后均呈明显的上调趋势(表3)，结果表明在绕实蝇危害后JA信号通路上的HrJA2、HrLOX1、HrAOS和HrAOC这4个基因可能被激活。进而我们对受到绕实蝇危害的抗性植株中4个基因的表达情况进行了分析，结果发现在检测的基因中HrJA2基因上调表达达到极显著水平，12 h表达量约为0 h的11倍左右(图5)。

表3 基于绕实蝇危害前后沙棘转录组数据JA合成途径中关键基因的表达量分析①Tab.3 The expression levels of key genes in the JA synthesis pathway of seabuckthorn were analyzed based on transcriptome data under RBO

图5 绕实蝇危害后沙棘植株内茉莉酸信号途径中关键基因表达量Fig. 5 Expression levels of key genes in JA signaling pathway in the resistant plants under RBOA、B、C、D分别为RBO胁迫下HrJA2、HrLOX1、HrAOS和HrAOC基因的表达模式分析。A, B, C and D are the expression patterns of HrJA2, HrLOX1, HrAOS and HrAOC genes under RBO stress.

3 讨论

随着转录组学、代谢组学和蛋白质组学等多种组学及分子生物学方法的快速发展，目前已对植物转录因子家族在生物胁迫等方面的生物学功能开展了大量研究，并在不同水平的分子调控机制上取得了显著成果。然而，关于沙棘HrWRKY转录因子家族成员调控沙棘抗绕实蝇危害的具体分子机制还鲜见报道。本研究基于实验室前期沙棘转录组数据及定量分析结果，挖掘并分析了沙棘HrWRKY53转录因子的分子序列特征，并通过RBO及相关激素处理后，对沙棘抗虫植株及敏感植株的HrWRKY53基因表达量进行了分析，探讨了HrWRKY53调控沙棘抗绕实蝇过程中的作用机制，为进一步研究沙棘WRKY转录因子家族的抗虫机制提供重要思路与线索。

3.1 HrWRKY53基因的结构及组织表达特异性

本研究基于沙棘转录组数据及荧光定量分析筛选获得1条与抗虫相关的差异表达的基因HrWRKY53，序列分析发现目的基因包含1 302 bp的开放阅读框，编码433个氨基酸，与其他WRKY蛋白序列比对发现该基因有2个WRKYGQK保守结构域，锌指蛋白为C2H2型，证明该基因属于第1类WRKY转录因子。其WRKY结构域含有4个β折叠，并有由1对半胱氨酸残基(Cys)与1对组氨酸(His)残基组成的锌离子结合功能结构，能与目标基因启动子中的顺式作用元件W-box(TTGAC序列)特异结合，从而调节目标基因的表达，其调控基因表达主要受病原菌、虫咬、机械损伤、外界胁迫压力和信号分子的诱导(文锋等， 2017)。有研究表明，C端的WRKY结构域在第Ⅰ类WRKY与DNA结合过程中起主导作用，而N端WRKY结构域的功能目前还不清楚，可能与WRKY转录因子与DNA特异序列的亲和力和结合特异性有关，通过提高其亲和力和特异性从而参与该家族转录因子与DNA相互结合的过程(Eulgemetal.， 1999； Maeoetal.， 2001)。

不同胁迫处理后，HrWRKY53基因在沙棘各组织中的表达情况显示，沙棘的叶片、果实和茎中均有表达且产生不同程度的改变。有研究发现，枸杞LbWRKY3在根中表达量最高，在花中表达量最低(徐惠娟等， 2016)； 丹参(Salviamiltiorrhiza)绝大多数WRKY基因也在根中呈现优势表达，总表达量较其他组织高(Lietal.， 2015)； 甜菜(Betavulgaris)WRKY基因在植物各组织中表达差异较大，WRKY总表达量在根中最高，在叶中表达量最低，大多数基因在根中优势表达(孔维龙等， 2017)。在绕实蝇危害后，HrWRKY53明显能被诱导表达，且在各个组织中均为上调表达，尤其是抗虫植株的果实和叶片表达量变化最为显著。可能是由于沙棘绕实蝇在对沙棘果实危害时，会对果实造成一定的机械损伤及病原菌残留，从而诱导该基因的表达，根据绕实蝇的取食情况等原因，故导致不同组织的表达量情况有所差异。

3.2 HrWRKY53基因的表达分析

已有研究表明，植物被细菌、真菌等及其激发子感染后，体内WRKY转录因子的转录水平、蛋白质水平及DNA结合活性都会显著提高，并且WRKY转录因子对抗病相关基因表达起着重要的调节作用(Eulgemetal.， 2007； Pandeyetal.， 2009)。如水稻中WRKY转录因子家族部分成员介导ET信号通路抗褐飞虱(Luetal.， 2014； Zhangetal.， 2015； Huetal.， 2015)； 菊花(Macrosiphoniellasanborni)中CmWRKY53调节菊花的次生代谢产物达到抗蚜虫的目的(Zhangetal.， 2020)； 棉花WRKY40介导JA信号通路提高棉花对白粉虱的抗性(Lietal.， 2016)； 拟南芥WRKY40介导BR参与其抗虫(Chenetal.， 2017)。基于本实验室前期绕实蝇危害前后沙棘转录组数据获得8个差异表达的HrWRKYs转录因子家族成员，进一步筛选发现转录因子HrWRKY53的表达水平在抗、感之间表现出显著差异。因此，笔者推测HrWRKY53具有抗虫功能并研究比较了沙棘抗虫植株和敏感植株在绕实蝇危害前后及激素诱导后HrWRKY53的表达情况。结果显示，该基因在抗虫植株的果实和叶片中上调极为显著。

植物激素在其生长发育及对逆境胁迫的响应方面有着很重要的作用(Barietal.， 2009)，它可以由外界的环境胁迫诱导产生，在植物体内往往以低水平调节各种生理反应。此前有研究发现，植物对昆虫口腔或产卵分泌物中特异性激发子的识别会激活植物体内多种植物激素信号途径，包括茉莉酸、水杨酸、脱落酸、乙烯、赤霉素等，这些信号途径进一步激活防御基因的表达及直接防御和间接防御化合物的产生，使植物表现出抗虫性(Howeetal.， 2008； Wuetal.， 2010； Erbetal.， 2012)。茉莉酸甲酯作为植物体内1种常见信号物质，在植物遭受病虫害损害时，会诱导植物产生挥发物来趋避害虫，从而减轻对植物的危害(徐伟等， 2010)。在研究过程中发现HrWRKY53基因在MeJA诱导下表达量显著升高，表明HrWRKY53基因表达可能可受到JA激素诱导来响应绕实蝇危害。笔者进一步发现绕实蝇危害后JA信号通路关键基因HrJA2表达水平显著上升。综上，本研究表明沙棘受到绕实蝇危害后，JA合成通路关键基因HrJA2表达量会显著上升，导致JA含量升高，从而诱导转录因子HrWRKY53的表达，提高沙棘植株的抗虫性。

4 结论

本研究基于沙棘转录组数据，获得了参与沙棘抗绕实蝇危害的HrWRKY53转录因子基因，其开放阅读框为1 302 bp，编码433个氨基酸。HrWRKY53基因所编码的氨基酸序列与蔷薇科草莓FvWRKY25氨基酸序列同源性最高，具有2个保守的WRKY结构，属于WRKY基因家族I类。该基因的表达具有组织特异性，其在沙棘果实中表达量最高； 同时不同激素处理后，HrWRKY53基因的表达均有一定变化，但对茉莉酸甲酯诱导响应更敏感，且绕实蝇危害后JA信号通路关键基因HrJA2表达量显著升高。本研究结果为沙棘抗虫分子机制的研究提供新的思路与视角，同时也为沙棘等胡颓子科植物的抗虫分子育种提供科学依据与基因资源。