极度濒危树种羊角槭的种胚发育与休眠解除

陈香波 刘 杨 赵明水 涂淑萍

(1.上海市园林科学规划研究院 上海 200232； 2. 上海城市困难立地绿化工程技术研究中心 上海 200232；3.江西农业大学园林与艺术学院 南昌 330045； 4.浙江天目山国家级自然保护区管理局 杭州 311300)



极度濒危树种羊角槭的种胚发育与休眠解除

陈香波1,2刘 杨1,3赵明水4涂淑萍3

(1.上海市园林科学规划研究院 上海 200232； 2. 上海城市困难立地绿化工程技术研究中心 上海 200232；3.江西农业大学园林与艺术学院 南昌 330045； 4.浙江天目山国家级自然保护区管理局 杭州 311300)

【目的】 揭示羊角槭的种胚发育与萌发抑制机制，获得破除休眠、提高种子发芽率的有效方法，以提高种群繁育效率，扩大羊角槭种群数量以缓解目前极度濒危的生存现状。【方法】 连续3年调查统计浙江天目山自然保护区2株人工种植羊角槭种胚发育结实情况，通过白菜种子发芽试验研究种子不同部位(外种皮、内种皮、种胚)的萌发抑制作用，并通过不同处理(剥除外种皮、激素浸种与低温沙藏)探索打破种子休眠促进萌发的方法。【结果】 羊角槭种胚发育不良且存在单株个体间差异，3年平均饱满种胚率仅9.73%～33.98%，饱满种胚平均生活力52.22%，饱满种胚率低于其他槭属植物。羊角槭内、外种皮与种胚均存在萌发抑制物质，外种皮与种胚提取物对于白菜种子的萌发抑制作用更强； 内源ABA含量测试发现，种胚ABA含量最高，达1 818.58 ng·g-1，其次为外种皮1 053.34 ng·g-1、内种皮859.05 ng·g-1，种子内各组织的萌发抑制作用与内源ABA含量直接相关； 采用不同处理方法(剥除外种皮、激素浸种与低温沙藏)打破休眠试验发现，未剥除种皮种子低温沙藏及种子剥皮室温沙藏均不能萌发，而剥去外种皮种子经一定时间的低温沙藏可打破胚休眠，使得种子萌发率提高到30%； 剥去外种皮种子进行不同激素(GA3，6-BA)、不同浓度与浸种时间处理，发现激素浸种时间对于羊角槭种子发芽率有极显著影响(P<0.01)，浸种激素种类或浓度均对羊角槭种子发芽率影响不显著(P>0.05)； 对剥除外种皮种子配合适当浓度的外源激素(GA3，6-BA)浸种处理再行低温沙藏可提高羊角槭种子发芽率，其中以100 mg·L-1GA3或200 mg·L-16-BA 浸种12 h效果最好，种胚发芽率分别达到46.67%与43.33%，可作为羊角槭打破休眠促进萌发的适合方法推荐应用。【结论】 羊角槭种子败育率高、空瘪现象严重，这与花粉供应限制有关，异株授粉作为自交补充有助于授粉成功、胚发育，在构建保护群落时应避免分散、零散的种植，减小个体间距、促进异交结实，以提高种群繁育效率； 羊角槭种子同时存在外种皮强迫休眠和胚休眠，内源ABA 是种子萌发的主要抑制物质； 通过剥除外种皮结合激素浸种、低温沙藏能够提高种子萌发率。该研究对于扩大羊角槭种群规模、实现这一极小种群树种的种群恢复与可持续保育目标具有重要意义。

羊角槭； 种胚发育； 种子休眠； 种子萌发； 休眠解除

羊角槭(Aceryangjuechi)为槭树科(Aceraceae)槭属(Acer)落叶乔木， 20世纪70年代末发现于浙江临安天目山海拔750～900 m的亚热带常绿、落叶阔叶混交林中，当时野外仅残存4株(方文培， 1981; 裘宝林， 1993)，为中国极度濒危物种，国家二级保护植物(中国科学院植物研究所， 1987)。羊角槭系古老的残遗种，与产自日本的日本羊角槭(Acermyabei)关系密切，对研究东亚植物区系的起源、演化以及古气候、古地理变迁，具有重要价值。羊角槭树形优美、树冠挺拔，翅果似羊角而得名，也是优良的园林绿化树种。

近年来由于低温冻害、植株衰退等原因，野生残存的几株羊角槭相继死亡，生存形势异常严峻。在国家林业局新近制定的《全国极小种群野生植物拯救保护工程规划(2011—2015年)》中，羊角槭被明确列入一期拯救保护的120种极小种群植物名录中，为9种野外数量不足10株的野生植物之一，属极度濒危、濒于灭绝的物种，亟待加强保护。迄今，有关羊角槭的研究报道资料甚少, 仅有个别关于光合荧光特性以及基因组DNA 提取分析亲缘关系方面的报道(钟泰林等, 2009； 钱永生等, 2007； 李倩中等, 2010)，对其生态习性与生殖生物学方面缺乏系统了解，人工繁殖不够成熟。

羊角槭天然更新能力弱，天目山自然保护区人工种植保留的15株已开花羊角槭树下及周围未发现1株更新幼苗。羊角槭种子败育率高、空瘪现象严重，发芽率极低(不及1%)，当地林场虽经多年的人工繁殖，保存至今也不过百株。以现有的繁殖方法，不仅不能有效扩大羊角槭种群、解除其极度濒危的境地，更无法满足园林应用种苗需求，因此提高繁殖效率已成为当前羊角槭种质保护所要面对的首要问题。

本研究通过对羊角槭种子不同部位(外种皮、内种皮、胚)内源萌发抑制测试研究羊角槭休眠的内在机制，并采取不同措施(剥去外种皮、激素浸种)促进萌发试验，探索破除羊角槭种子萌发抑制、提高种子发芽率的适合方法，为加快羊角槭种群繁育、扩大个体数量，缓解其极度濒危的生存现状探明出路。

1 材料与方法

1.1 羊角槭种胚发育统计

于2011年、2012年、2013年对天目山不同地点种植的2株羊角槭开花植株(记为A株与B株)分别采集种子，其中A株四周无遮挡、相对开阔，近旁紧邻1株已开花结实羊角槭； B株处山凹处杂木林中，三面被高大树木遮挡。2株均为1979年定植，树龄均为37年。将采集的种子剥出种仁，分别统计含饱满种胚、败育种胚以及空瘪的种子数量，计算不同发育状况种胚比率。

1.2 种胚生活力测定

于果实成熟期采集浙江西天目山自然保护区内人工种植的羊角槭大树翅果，将果翅去除保留带壳小坚果，置于阴凉干燥处阴干。按照ISTA(国际种子检验协会)种子检验规程，采用TTC染色法测定羊角槭种胚生活力(张志良， 1990； ISTA， 1996)。选取去除外种皮仅存内种皮包裹形态完整种胚的饱满种子30粒，分成3份，浸泡于温水(30 ℃)中3 h，使种子充分吸水膨胀。剥去内种皮后放入50 mL小烧杯中，用0.5%的2，3，5-三苯基氯化四唑(TTC)溶液在32 ℃恒温箱中黑暗染色12 h后取出，清水冲洗，统计种胚生活力。

1.3 种子萌发抑制试验

将羊角槭种子的外种皮、内种皮、胚分离，取外种皮、内种皮和胚各0.5 g在研钵分别研磨，研磨后放入150 mL锥形瓶中，分别加体积分数80%甲醇溶液100 mL，混合后放入4 ℃冰箱密闭浸提，每隔1 h震荡1次，使充分浸提，60 h后取出过滤，得到醇提液。用此醇提液作为原液，将其稀释为体积分数5%，10%， 20%，30%，40%不同浓度，同时取80%甲醇溶液作为原液，分别稀释为体积分数5%，10%， 20%，30%，40%作为甲醇对照。用以上不同浓度甲醇提取液与甲醇溶液分别浸泡白菜(Brassicacampestris)种子3 h，每处理设3个重复，每重复100粒白菜种子。将浸泡好的白菜种子置于有滤纸的培养皿中，对应加入一定量浸泡液使种子浸润其中，于25 ℃恒温全光照条件下培养，48 h后测定发芽率，以蒸馏水处理的白菜种子作为对照(吴小娴等， 2008)。

1.4 种子内源ABA含量测试

分别称取一定量的外种皮、内种皮与种胚用超细粉碎机研磨成干粉状待测。采用UPLC-MS/MS测试羊角槭内源ABA含量，该测试在北京林业大学公共分析测试中心完成。取约50 mg研磨好的植物样品加入2 mL离心管中，加入0.5 mL提取液同时加入D6-ABA内标，放入摇床摇30 min，然后加入1 mL的二氯甲烷，再继续摇30 min，离心，取二氯甲烷相，氮吹仪吹干，加入0.1 mL的流动相初始液，进行UPLC-MS/MS检测。检测条件： Agilent 1260-AB Qtrap5500； 流动相： 乙腈∶0.1%的乙酸水，梯度洗脱0 min时，乙腈10%，到了5 min时，乙腈95%； 色谱柱： Agilent C18柱，1.8 μm，4.6 mm×50 mm； 质谱： ESI源。

1.5 种子休眠解除处理

将阴干后种子在自来水中浸泡1周，去除漂浮上层种子，收集下层饱满种子，进行处理。1)剥去外种皮处理： 用尖头镊子与手术刀片配合小心剥去外种皮，注意不伤害内种皮，使内种皮包裹种胚完整。2)外源激素处理(表1)： 将剥去外种皮的饱满种子浸泡在不同浓度赤霉素GA3(50，100， 200 mg·L-1)或不同浓度细胞分裂素6-BA(50，100， 200 mg·L-1)溶液中，均分别处理12 h与24 h，期间每隔1 h震荡摇动1次。

表1 种子外源激素处理Tab.1 Seed prosoaking with exogenous hormine

将上述种子于0.5‰KMnO4溶液中浸泡消毒10 min，自来水冲涮3次。与事先经5‰KMnO4熏蒸消毒处理的湿沙相混合，置于0～5 ℃冰箱低温层积。于2012年12月5日完成处理，10天观察1次，至发现有内种皮裂开、胚根伸出，开始有种子发芽始，每隔半月统计1次发芽率至不再出现种子发芽为止。及时将种胚裂开、胚根初伸长的解除休眠的种子播入萌发基质中，萌发基质为园土∶草炭∶珍珠岩=2∶2∶1(体积比)，使3种成分充分混合。发芽记录以胚根突破种皮2 mm计为种子发芽[种子发芽率(%)=发芽种子数/供试饱满种子总数×100]，每处理设3个重复，每重复10粒形态完整的饱满种胚。以未剥去外种皮饱满种子低温沙藏为对照(CK-0)，剥去外种皮未进行激素处理种子分2份： 1份室温沙藏(CK-N)，另1份进行低温沙藏(CK-L)，沙藏及种子播种方法同上。

1.6 数据处理与统计分析

试验数据采用SPSS16.0进行多因子方差分析(罗应婷等， 2008)，对于差异显著者，进一步用DPS统计软件进行Duncan多重比较(唐启义等， 2007)，字母法标记。做图在Excel软件下完成。

2 结果与分析

2.1 种胚发育

对羊角槭植株不同年份采集的种子发育情况统计发现，羊角槭饱满种胚率非常低，3年平均值仅33.98%(A株)或9.73%(B株)，而败育、空粒所占比率较高，二者总和甚至超过总种子数的90%(B株)。种胚发育存在单株间差别，A株的饱满种胚率(28.83%～39.34%)高于B株(4.92%～13.73%)，表明A株羊角槭结实优于B株(图1)。不同年份间种胚发育存在一定波动， 2011年为3年中结实最好的一年。与其他槭属植物比较，羊角槭正常种胚率3年中最高仅39.34%，远低于毛果槭(A.nikoense)92.50%、安徽槭(A.anhweiense)92.00%、橄榄槭(A.olivaceum)94.00%、昌化槭(A.changhuaense)91.50%和色木槭(A.mono)93.00%(石柏林等， 2006)，证实羊角槭种子败育率高、空瘪现象极为严重。

图1 羊角槭种胚发育情况Fig.1 Embryo development of Acer yangjuechi seeds

图2 羊角槭种子结构与发育Fig.2 Seed structure and development of Acer yangjuechiA．翅果； B. 坚果； C. 饱满种子； D. 去内种皮种胚； E. 示子叶折叠状种胚； F. 发育完全种胚； G. 干缩败育种胚； H. 透明状子叶败育种胚； I. 黑化变质无生活力种胚； J. 子叶折叠异常无生活力种胚。A. Samara; B. Nut; C.Well-developed seed; D. Endotesta-removed embryo; E. Cotyledon-enfolded embryo; F. Well-developed embryo; G. Aborted embryo; H. Transparent aborted embryo; I. Black vitality-loss embryo; J. Abnormal cotyledon-enfolded embryo.

羊角槭种子于当年10月份成熟，两翅夹角几近水平(图2A)，除翅后的小坚果形似贝壳，卵圆形至长卵圆形，棕黄色，先端有突起的短钝尖头，上下两面凹凸不平，有沟状网纹(图2B)，种脐呈扁长卵形。外种皮木质化、坚硬，内种皮薄膜质。子叶扁平，依伏式折叠(图2C，D，E)。

羊角槭饱满种胚形态椭圆形，几乎占满外种皮包裹空间(图2F)，而中途败育种子表现出种胚干缩停止发育或仅发育透明状子叶，个别种子出现黑化现象(图2G-J)。饱满种胚虽形态完整，但并非一定具备萌发能力，需对饱满种胚生活力进行检测。TTC染色法检验结果显示，不同年份羊角槭饱满种胚生活力在50.00%～53.33%间，变异幅度不大，平均52.22%(图3)。饱满种胚不具备生活力，主要体现在种胚发育不良出现异常情况，如子叶黑化变质(图2I)、种胚发白子叶折叠异常(图2J)等，这部分种子即使给予适合的萌发条件也难以正常萌发。

图4 羊角槭种子各部位浸提液对白菜种子萌发的抑制作用Fig.4 Inhabitation effect of extractant from different seed tissues of Acer yangjuechi on cabbage seeds germination图中的不同字母表示有显著性差异(P<0.01)。大写字母表示同一浸提液浓度中蒸馏水对照、甲醇对照、外种皮提取液、内种皮提取液、胚提取液五者之间的显著性差异比较； 小写字母表示蒸馏水对照、甲醇对照、外种皮提取液、内种皮提取液、胚提取液在不同浸提液浓度间的差异显著性比较。Different letter means significant influence(P<0.01). Capital letter means significant level among CK of distilled water, CK of manthanol, extractant of testa, extractant of endotesta, and extractant of embryo at the same concentration. Small letter means significant level among the different concentration extractants including CK of distilled water, CK of manthanol, extractant of testa, extractant of endotesta, and extractant of embryo.

图3 羊角槭种胚生活力Fig.3 Viable embryo rate of Acer yangjuechi

2.2 种子萌发抑制作用

羊角槭外种皮、内种皮和种胚提取液对白菜种子萌发的抑制结果见图4。种子各部分(外种皮、内种皮、种胚)均存在萌发抑制物质，各浓度提取液较甲醇对照白菜种子发芽率均有所降低，浓度超过10%以上时，与甲醇对照间差异极显著(P<0.01)。随提取液浓度升高，白菜种子发芽率呈下降趋势，对于白菜种子萌发的抑制作用增强，不同提取液浓度间差异达到极显著水平(P<0.01)。浓度为30%的外种皮、种胚提取液已完全抑制白菜种子萌发，发芽率降为0，内种皮提取液浓度达40%时仍有极个别白菜种子发芽(发芽率2%)，说明外种皮与种胚提取液对于白菜种子发芽抑制作用更强。

2.3 种子内源ABA含量

采用高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)方法对羊角槭外种皮、内种皮、种胚内源ABA含量进行检测，发现羊角槭种子内源ABA含量异常高，其中种胚ABA含量最高，达1 818.58 ng·g-1，其次为外种皮1 053.34 ng·g-1、内种皮859.05 ng·g-1，与种子各部位浸提液对白菜种子萌发的抑制作用相吻合。对比同是槭属植物的色木槭成熟种胚ABA含量216.44 ng·g-1(杨玲等， 2012)，羊角槭种子内源ABA含量异常之高，由此可断定ABA即是自然条件下羊角槭种胚抑制萌发的关键化学物质。

2.4 种子休眠的解除

2.4.1 剥皮与低温沙藏处理对羊角槭种子萌发的影响 羊角槭外种皮坚硬、木质化，种皮与种胚均含有萌发抑制物质。以带种皮饱满种子低温沙藏及种子剥皮室温沙藏，种子无任何反应、发芽率为0； 而剥去外种皮、内种皮包裹完整的饱满种胚进行低温沙藏，发芽率30%，与前二者差异达极显著水平(P<0.01)(图5)。随沙藏时间延长，种胚逐渐由处理前的干瘪表面皱褶而变得吸胀饱满，2个月后开始种皮稍有裂开，有胚根伸出(图6A)。将解除休眠种子播入萌发基质中，外界温度10～25 ℃出土萌发，3天后子叶伸展(图6B)，5周后获得带2片真叶、正常健壮的实生苗(图6C)，种子发芽率30%(图5)。自低温沙藏处理76天始持续近2个月时间陆续有种子发芽，至处理后130天，种子萌发结束，历时54天。羊角槭外种皮不仅对种子吸水有物理性限制作用(许小连等， 2012a)，对种子萌发抑制作用也非常明显，带外种皮种子种胚几乎无法突破外种皮抑制而正常萌发。室温放置剥去外种皮种子不能萌发，说明羊角槭具有胚休眠特性，胚内含有萌发抑制物质，必须要经过一定时间的低温沙藏层积解除休眠才能够萌发。

图6 羊角槭种子萌发Fig.6 Germination of Acer yangjuechi seedsA.胚根伸出、种胚萌发； B.子叶苗； C.具2片真叶萌发苗。A. Radicel stretching and embryo germination; B. Seedling with cotyledon; C. Seedling with two euphylla.

图5 剥皮及低温沙藏处理对羊角槭种子萌发的影响Fig.5 Effect of testa-removing and stratification on seed germination of Acer yangjuechi图中不同大写字母表示种子发芽率差异显著(P<0.01)。Different letters mean significant influence(P<0.01).

2.4.2 不同激素处理浓度及时间对羊角槭种子萌发的影响 剥去外种皮种子进行不同激素(GA3，6-BA)浸种，不同浓度(50，100，150 mg·L-1)、不同时间(12，24 h)浸种处理对于羊角槭种子发芽产生一定影响(表2)。较未剥皮对照，所有激素处理均能显著提高羊角槭种子发芽率，种子发芽率为10%～46.67%，其中以100 mg·L-1GA3浸种处理12 h(A1B2C1)发芽率最高，达到46.67%，其次是200 mg·L-16-BA浸种处理12 h(A2B3C1)，种子发芽率43.33%； 发芽率为30%～40%的激素处理分别是200 mg·L-1GA3浸种处理12 h(A1B3C1)、24 h(A1B3C2)或50 mg·L-16-BA浸种处理12 h(A2B1C1)。以上处理种子发芽率均超过剥去外种皮未进行激素处理的种子发芽率，表明适当的激素浸种处理可以提高羊角槭种子发芽率，可在剥去外种皮基础上做到进一步的提升； 其他激素处理则未能达到提升种子萌发效果。对GA3与6-BA 2种激素处理发芽结果分析发现： GA3激素处理，在低浓度50 mg·L-1时随浸种时间的延长(12 h→24 h)，发芽率有所提高，但浓度提高到100 mg·L-1以上时，随浸种时间的延长，种子发芽率反而下降； 相同的浸种时间，浸种12 h，最大种子发芽率出现在100 mg·L-1时，而处理24 h，GA3200 mg·L-1时种子发芽率最大。6-BA激素处理，所有浓度下较长时间浸种(24 h)总是不及短时间浸种(12 h)发芽率高， 200 mg·L-1浓度下处理12 h是所有6-BA激素浸种处理中发芽率最高的，为43.33%。总体比较，100 mg·L-1GA3或200 mg·L-16-BA浸种12 h能提高羊角槭种子发芽率至40%以上接近50%，占有生活力种子的比率分别为89.37%与82.97%，说明该方法实现了绝大多数饱满且具生活力种子的休眠解除萌发。

方差分析表明，激素浸种时间(C因子)对于羊角槭种子发芽率有极显著影响(P<0.01)，浸种激素种类与浓度对羊角槭种子发芽率影响未达显著水平(P>0.05)，各处理交互作用对发芽率没有显著影响。浸种12 h与24 h平均发芽率分别为33.33%和20.56%，两水平间差异达到极显著水平，无论是GA3或6-BA激素，浸种12 h有利于羊角槭种子萌发。激素不同浓度处理间Duncan多重比较，同样是GA3浸种处理， 200 mg·L-1浓度下平均发芽率最高(35%)，显著高于100 mg·L-1浓度(平均发芽率28.33%)与50 mg·L-1浓度(平均发芽率16.67%)； 6-BA浸种处理，不同浓度间差异未达显著(P>0.05)。

表2 不同激素处理对羊角槭种子萌发的影响①Tab. 2 Effect of different hormone-presoaking on seed germination of Acer yangjuechi

①同一列中不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示不同处理间差异极显著(P<0.01)。Different capital letter means extremely significant difference among treatments(P<0.01), and small letter means significant difference among treatments(P<0.05).

3 讨论

3.1 槭属植物繁育系统与种胚发育

槭属植物的种胚发育与其繁育系统密不可分。大多数槭属植物花为杂性，雄花和两性花同株，稀单性、雌雄异株(方文培， 1981)。为使繁殖成功最大化，在槭属植物中特化出雌雄异型异熟的繁育机制，即种群中包括2种交配型(柱头先熟、花粉先熟)，当一个交配型释放花粉时，另一交配型植株的柱头正处于成熟可授期， 而后对换角色。雌雄异型异熟被认为是有花植物为避免自交、提高2种交配型互交成功的一种进化策略(Gleeson,1982; Pendletonetal., 2000; Kimuraetal., 2003; Baietal., 2007)。另一种更加特化的二重雌雄异型异熟在槭属植物中也较为普遍，其特点是具有2期雄花，2期雄花差别很大，雌雄功能按照雄—雌—雄顺序依次表达，其交配系统更为复杂。

槭属植物雌花都具有单性结实倾向，子房虽然能够继续膨大，但仅有部分胚可以正常发育，部分败育(De Jong， 1976)。落果现象在槭树科植物中普遍存在，贯穿于开花后至果实成熟的整个时期，一般来说，中途脱落的果实大都为非正常授粉受精的果实(Shibataetal., 2009)。对于具有二重雌雄异型异熟繁育机制的槭属植物来说，种群密度、交配型数量与比例等决定授粉成功的诸多因素均会影响种子发育水平。在一定距离范围内，色木槭不同交配型个体数量越多则授粉成功几率越高，正常发育种子所占比率也越大，而随不同交配型个体间距离变大，未成熟种子掉落和空种子比率也将随之增多。不同交配型间分配数量和距离直接影响着授粉成功与种子结实。除此以外，交配型间授粉成功概率也存在不同，雌性先熟较雄性先熟交配型植株有着更少的未成熟种子掉落，该交配型获得了更高的传粉效率，正常种子结实率也稍高(Shibataetal., 2009)。

据笔者对羊角槭开花生物学观察，同一植株上同时存在两性花与雄花，个别年份还观察到2种形态的雄花(许小连等， 2012b)，单个植株存在相对分隔的两性花期(雌性成熟)与雄花期(雄性成熟)，两性花期集中在1～2天，略先于雄花期，两者成熟数量极为不对等，大多数两性花柱头成熟处于可授粉期时该树体则只有不及10%雄花处于成熟期，只能更多依赖群体内其他单株开放雄花提供花粉(待发表)，因此推测受花粉限制授粉成功率低是羊角槭种胚发育率不高的最主要原因。A株与B株羊角槭种子育性的不同，很可能与A株近旁紧邻1株同样开花结实羊角槭有关，羊角槭部分自交可育，距离相近的植株，便于彼此相互授粉，促成异交结实利于繁殖成功。至于其繁育系统是否确切为二重雌雄异型异熟性别分化系统还需不同年份跟踪做进一步研究。

3.2 槭属植物种子休眠原因与解除

槭属植物种子具有休眠特性，需进行一定阶段的低温(5 ℃)潮湿冷藏以打破休眠促进萌发(Pinfieldetal.,1985)。槭属植物的种子休眠分胚休眠与外种皮强迫休眠2种形式。胚休眠的内因在于含有ABA等萌发抑制物质阻碍了种子萌发，通过低温潮湿冷藏可降低种子内部游离ABA含量以打破休眠(Pinfieldetal., 1990)； 而对于外种皮强迫休眠类型，剥除种皮的种子在适合温度光照条件下即可萌发，元宝槭(A.truncatum)即属此类(孙秀琴等， 1991)。欧亚槭(A.pseudoplatanus)是槭属中1个特例，完整带外种皮种子需放入潮湿低温(5 ℃)条件下数周得以萌发，若去除外种皮，仅有约50%种胚萌发而另一半种胚仍需经低温(5 ℃)湿藏一段时间萌发(Webbetal., 1969； Pinfieldetal., 1990)，欧亚槭既有胚休眠又兼具外种皮强迫休眠，其种子萌发抑制物质， 除了胚中内源ABA之外，还有中性复合物存在，种皮主要是阻碍胚内萌发抑制物质的对外溶解从而导致胚的被迫休眠(Webbetal.,1972)。从本研究结果看，羊角槭内、外种皮以及胚内均存在萌发抑制物质，萌发抑制物质被证明是高含量的内源ABA，尤以种胚内含量最高、抑制作用最强，其次为外种皮，说明内源ABA 是羊角槭种子萌发的主要抑制物质。羊角槭有着类似欧亚槭既有外种皮强迫休眠也具胚休眠的特征，但羊角槭的外种皮抑制作用不仅是机械阻碍种胚内抑制物质溶解，它本身就具有萌发抑制物质存在，带种皮种子即使低温沙藏也不能萌发，而剥去外种皮种子100%都存在胚休眠，需要一定时间的低温沙藏以打破胚休眠，而不像欧亚槭近一半种胚不存在胚休眠，可即时萌发。

打破胚休眠，低温湿沙储藏对大多数槭属植物是适用的，较常温储藏，种子发芽率显著提高且发芽时间提前(石柏林等， 2006)。赤霉素浸种有助于减少三角槭(A.buergerianum)低温层积所需时间，但对发芽率增进效应不明显(肖志成等， 2008)； 激动素处理欧亚槭种子可以诱导未低温湿藏种子萌发(Pinfieldetal., 1990)。不同处理打破槭属植物种子休眠萌发都与其内源ABA含量降低有着直接关系。具体到促进萌发的形态功能表现，有研究发现细胞分裂素类激素(激动素)主要是刺激诱导胚根突出向地性生长，而赤霉素GA3则是靠加速子叶伸展而起作用(Pinfieldetal., 1990)。种子打破休眠的过程实际就是萌发促进因子(细胞分裂素、赤霉素)与萌发抑制物质(ABA等)间相互“较量”的过程，就羊角槭而言，剥去外种皮种子避除了外种皮的抑制干扰，而种胚休眠的解除除了需要低温湿沙储藏外，促进萌发激素类的应用无疑是有增进萌发的作用，较清水浸种处理，适合浓度的赤霉素或6-BA浸种都提升了种子萌发率，但对种子发芽时间提前作用不大。

4 结论

羊角槭种子败育率高、空瘪现象严重，与花粉供应限制有关，异株授粉作为自交补充有助于授粉成功、胚发育，因此在实施羊角槭种群保护时应考虑尽量缩短个体间距，避免现有天目山保护区内人工种植羊角槭多呈分散、零散的种植，促进异交结实，划出一定区域建立羊角槭适生群落实施就地保护，提高种群繁育效率。

羊角槭同时存在外种皮强迫休眠和胚休眠，内源ABA 是种子萌发的主要抑制物质； 通过剥除外种皮结合激素浸种、低温沙藏能够提高种子萌发率。通过低温湿沙储藏配合一定浓度激素应用可使羊角槭种子萌发率达到46.67%，使得萌发种胚占到饱满种胚的接近50%，这与饱满种胚中52.22%是带有生活力种胚相比，数值非常接近，说明大多数(89.37%)有生活力种子实现了打破休眠萌发，这对于极度濒危树种的种苗繁育有着极为重要的意义。进一步配合实施种苗培育工程，扩大羊角槭种群达到一定规模，将有望实现羊角槭这一极小种群濒危植物种群恢复与保育的长远目标。

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(责任编辑 徐 红)

Embryo Development and Dormancy Releasing ofAceryangjuechi, the Extremely Endangered Plant

Chen Xiangbo1,2Liu Yang1,3Zhao Mingshui4Tu Shuping3

(1.ShanghaiAcademyofLandscapeArchitectureScienceandPlanningShanghai200232; 2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofLandscapingonChallengingUrbanSitesShanghai200232; 3.CollegeofLandscapeArchitectureandArt,JiangxiAgriculturalUniversityNanchang330045; 4.ManagementOfficeofTianmushanNationalNatureReserveHangzhou311300)

【Objective】The study was to reveal the seed dormancy mechanism ofAceryangjuechiand to obtain the effective dormancy-releasing method of improving seed germination, so as to improve the breeding efficiency, expand population size to mitigate the situation of being extremely endangered. 【Method】Seed development of two different individuals growing in National Nature Reserve of Tianmu Mountain, Zhejiang province, was tested in 3 successive years. Through cabbage seeds germination test, the germination inhabitation of testa, endotesta and embryo was conducted. The techniques for seed dormancy releasing were studied by treatment of hormone-presoaking or stratification of testa-removed seeds at 5 ℃. 【Result】Embryo ofAceryangjuechiwas poorly developed and differs between the two individuals. The average percentage of well-developed seeds ranged from 9.73% to 33.98% and the average rate of viable seeds was 52.22%. Compared with otherAcerplants, the lower percentage of well-developed seeds confirmed its high infertility rate. The methanol extractant from testa and embryo had the higher inhabitation effect on germination than that from endotesta which have a high correlation with the content of endogenous ABA. The content of endogenous ABA in embryo was the highest one, reaching 1 818.58 ng·g-1, followed by those in testa with a value of 1 053.34 ng·g-1and endotesta with a value of 859.05 ng·g-1. The complete seeds moist-stored at 5 ℃ and testa-removed seeds at room temperature can not germinate while the testa-removed seeds germinated and the germination rate increased significantly to 30%. And the treatment of presoaking seeds with 100 mg·L-1GA3or 200 mg·L-16-BA for 12 hours promoted seed germination rate reaching to 46.67% and 43.33% respectively. The duration of seeds-presoaking with hormone had a significant influence on germination rate of seeds(P<0.01)while hormone type and concentration didn’t present significant influence(P>0.05).【Conclusion】Seeds ofAceryangjuechioften has a high rate of infertility and become empty seeds, this is associated with limitation pollen supply. Outcrossing as a supplement to self-pollination favors pollination success and embryo development. Stands of the species should be planted in small tree-tree distance to promote outcrossing which leads to successful reproduction. Both forced dormancy by testa and embryo dormancy are existing in the seeds ofA.yangjuechi. The main inhibitor of seed-germination is the endogenous ABA. Low temperature sand stratification of testa-removed seeds combined with hormone-presoaking could improve germination rate. It is recommended as the method for seed dormancy-releasing. The study is of significant implication to population enlargement and sustainable conservation ofAceryangjuechi.

Aceryangjuechi; embryo development; seed dormancy; seed germination; dormancy releasing

10.11707/j.1001-7488.20170408

2016-05-05；

2016-11-09。

上海市绿化与市容管理局辰山植物园专项“几种濒危植物致濒机制与种质资源保护研究”(G102406)。

S723.1+3

A

1001-7488(2017)04-0065-09