施用贝壳粉对酸化土壤微生物多样性及平邑甜茶幼苗生长的影响*

赵晓红 柴姗姗 张曼曼 范义昌 毛云飞 毛志泉 沈 向

(山东农业大学园艺科学与工程学院 国家苹果工程技术研究中心 泰安 271018)

微生物在土壤营养元素循环、土壤肥力形成和发展、生态环境改善、植物生长和土传病害防治等许多方面起着极为重要的作用，是土壤生物多样性、土壤生物区系的重要组成和功能组分(孙棣棣等， 2011)。土壤pH值可影响土壤微生物群落的组成和数量(林生等， 2012)。当土壤酸化或土壤pH值过低时，微生物的群落结构和数量发生显著变化，适宜中性至微碱性环境的细菌的活性受到严重影响，而一般比较耐酸的真菌滋生，则使植物根际病害加重(尹永强等， 2008)。

我国的区域性土壤酸化问题日益显现，严重威胁林果业可持续发展，如山东胶东半岛是我国目前产量最高的苹果生产区，但土壤酸化严重影响苹果的产量与品质(曹裕等， 2013； 周海燕等， 2019)，是一个亟待解决的问题。土壤酸化调理剂有很多，如石灰、碱渣、菇渣、污泥、泥炭、生物质炭等，其应用均取得了一定效果。我国贝类产量居世界第一，每年超过1 000万t，随之产生的大量贝壳被作为固体废物堆放在垃圾场或填海(李海晏， 2012)。实际上贝壳中碳酸钙含量达90%以上，是生物碳酸盐的主要来源，可用于医药、食品保健、处理污水、制作各种添加剂及土壤修复等领域。但在酸化土壤改良研究方面还鲜见报道。据此，笔者以苹果砧木——平邑甜茶(Malushupehensisvar.mengshanensis)幼苗为材料，研究施加不同粒径的贝壳粉调理剂后的酸化土壤pH值、幼苗生长量及土壤微生物多样性的变化，揭示贝壳粉对酸化土壤的改善效果，以期为酸化土壤改良提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计 2017-03-05，在山东省烟台招远市苇都梁家村果园，挖取酸化土壤(棕壤土)500 kg，充分混匀、搅拌后，测定其初始pH值为5.45。取酸化土9 kg、土壤调理剂1 kg装入内径30 cm、高25 cm的花盆内作为1个处理。土壤调理剂有3种(3个处理)。对照为每盆装酸化土9 kg、河沙和有机肥各0.5 kg。试验重复3次。每盆栽入2株长势一致的1年生平邑甜茶幼苗，并对幼苗统一定杆、剪砧到15 cm，株间距为5 cm。各处理均常规化管理，即定期浇水，一次性施入肥料且不追肥，同时观察幼苗生长状况。

1.2 调理剂配制 将大粒贝壳粉(10目)、中粒贝壳粉(20目)、小粒贝壳粉(100目)各0.5 kg分别与0.5 kg有机肥混合制成3种调理剂。贝壳粉主要成份的质量分数分别为碳酸钙955.8 g·kg-1、钙382.3 g·kg-1、有机质6.28 g·kg-1、蛋白质16.5 g·kg-1； pH值为9.28。有机肥为山东青岛明月海藻有机肥，其有机质质量分数≥450 g·kg-1。为保证对照组的总质量也是10 kg，在对照组中添加与处理组贝壳粉等质量的河沙(表1)。

表1 不同粒径的贝壳粉土壤调理剂①Tab.1 Shell powder with different particle sizes used as soil conditioners

1.3 样品采集 2017-09-12，用四点法从距幼苗根颈5 cm处采集0～10 cm土层的土壤，对3个重复分别采样，合计15 g，混匀后装入5 mL的离心管，并放入液氮中3～4 h，之后将备好的土壤样品送至北京百迈客生物科技有限公司，进行土壤微生物测定。

1.4 微生物高通量测序 1)土壤微生物基因组DNA的提取 采用E.Z.N.A© Soil DNA Kit(OMEGA，美国)的试剂盒方法，称取0.5 g于-20 ℃冰箱保存的土壤样品，按试剂盒的试验步骤进行土壤微生物总DNA的提取，DNA样品于-20 ℃冰箱保存待用。

2)试验流程 提取样品总DNA后，根据设计得到细菌V3+V4和真菌ITS1的引物，合并引物接头，进行PCR扩增并对其引物进行纯化、定量和均一化，形成测序文库，经质检，合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。高通量测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别(Base Calling)分析，转化为原始测序序列(Sequenced Reads)。

3)信息分析流程 数据预处理： 根据PE reads之间的Overlap关系，将Hiseq测序得到的双端序列数据拼接(Merge)成一条序列Tags，同时对Reads的质量和效果进行质控过滤。主要有如下3个步骤： PE reads拼接： 使用FLASH v1.2.7软件，通过overlap对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列即原始Tags数据(Raw Tags)； Tags过滤： 使用Trimmomatic v0.33软件，对拼接得到的Raw Tags进行过滤，得到高质量的Tags数据(Clean Tags)； 去除嵌合体： 使用UCHIME v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据(Effective tags)。

1.5 叶绿素质量及土壤pH值和贝壳粉成分测定 叶片叶绿素相对含量参照罗青红等(2017)的方法，用SPAD-502便携式叶绿素仪测定。用HY-353卷尺测定幼苗株高。土壤及贝壳粉pH值参照邓彩云等(2017)的方法，用FE28-Standard pH计测定。贝壳粉的碳酸钙质量采用EDTA滴定法测定(杜成智等， 2018)，蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定(乐薇等， 2016)，有机质含量采用重铬酸钾容量-稀释热法测定(夏静芬等， 2010)。

1.6 数据统计分析 使用软件Mothur计算丰富度指数Chao和Ace，多样性指数Simpson和Shannon。使用R软件绘制稀释曲线，基于RDP Classifier软件对OTU进行物种注释，用Excel和R语言工具对样品物种组成及相对丰度统计结果绘制柱状图、韦恩图和主坐标分析图及样品热图，利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制成样品各分类学水平下的群落结构图，使用Excel和SPSS进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 调节后的土壤pH值变化 分别在8、9、10月份测定了各处理和对照的土壤pH值(图1)，CK的土壤pH值为5.51，与原始pH值(5.45)很接近，即变化很小； 加入贝壳粉调理剂后的土壤pH值显著提高到6.5～7.2的范围。3个月份中均以XLB处理的pH值最高，最高值为7.13。

2.2 测序结果分析 对12个样品的细菌多样性的测序共测得原始序列条数819 811，有效序列总数为736 515，有效序列比例均大于72%。真菌多样性测序共测得原始序列条数801 046，有效序列总数为782 991，有效序列比例均大于81%，各样品的相关数据如表2所示。

稀释曲线(Rarefaction Curve)用来评价测序量是否足以覆盖所有类群，并间接反映样品中的物种丰富度。当曲线趋于平缓时也就可以认为测序深度已基本覆盖到样品中的所有物种。从稀释曲线图2可知，当细菌序列数量达到1 500，真菌序列数量达到400时，各样品稀释曲线均基本趋于平缓，说明取样基本合理，可真实的反映土壤样本中的细菌和真菌群落。

图1 不同粒径贝壳粉调理剂对土壤pH值的影响Fig.1 Effect of shell powder conditioners with different particle sizes on soil pH value不同小写字母表示同月不同处理在P<0.05水平上的差异Different lowercase letters in the figure are significantly different among different treatments in the same month at P<0.05 level.

表2 土壤样本细菌和真菌测序结果统计Tab.2 Sequencing results of bacteria and fungi in soil samples

图2 土壤样本细菌(左)、真菌(右)稀释曲线Fig.2 Rarefaction curve of bacteria (left), fungi (right) in soil samples各处理后的数字1、2、3分别表示各处理的1、2、3组重复The number after each treatment is 1，2，3 respectively representing 1， 2，3 groups of repeats for each treatment.

2.3 不同处理的群落丰富度和多样性 Chao和Ace指数用于衡量群落物种丰富度。Shannon和Simpson指数用于反映微生物多样性，在物种丰富度相同时，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，物种多样性越高(Pittaetal., 2014; Sunetal., 2015)。

由表3可知，在细菌数量中，3种贝壳粉调理剂处理均显著提高了Ace、Chao和Shannon指数，降低了Simpson指数，与CK相比，提高和降低幅度最大的处理均为ZLB，提高幅度分别为53.84%、49.85%和14.21%，降低幅度为54.76%。在真菌数量中，3种贝壳粉处理均显著降低了Shannon指数，与CK相比，降低幅度最大的处理为DLB，降低幅度为44.02%； 除XLB外，DLB、ZLB均显著提高了Simpson指数，与CK相比均提高了11.5倍； 3个处理的Ace和Chao指数与CK均无显著性差异。由此可见，3种贝壳粉处理均可显著提高细菌的丰富度和多样性，降低真菌的多样性。

表3 施加不同粒径贝壳粉土壤调理剂土壤样本的细菌和真菌群落的丰富度和多样性指数①Tab.3 Soil sample community abundance and diversity index with different shell powder conditioners of different particl sizes

图3 样品细菌(左)、真菌(右)OTU分析Fig.3 Cluster analysis of bacteria (left) and fungi (right) OTU

2.4 不同处理群落Alpha多样性分析 为研究各群落物种组成的多样性，对Tags在97%的相似度水平下将优化序列进行聚类，获得OTU，并基于Silva(细菌)和UNITE(真菌)分类学数据库对OTU进行分类学注释。如图3—6所示，在97%的相似度水平下，得到了每个样品的OTU个数，同时绘制Venn图展示样品(数目2到5)间共有、特有的OTU数目，直观表现样品间OTU重叠情况。结合OTU所代表的物种，可以找出不同环境中的共有微生物。

由图3、4(左)可知，在细菌水平上，12个样品测序共获得918～1 837种水平分类的细菌(OTU)，其中共有OTU为1 914个，特异性OTU为0～207个，与CK相比，3种贝壳粉处理均提高了细菌总OTU数量，降低了细菌特异性OTU数量，且ZLB的处理效果最明显，其中CK第一组OTU数量为918个，ZLB第一组数据OTU数量为1 837个，与CK相比提高了1倍。与CK相比，ZLB、DLB均最大程度降低了酸化土壤中细菌特异性OTU的数量。ZLB、DLB处理将特异性OTU数量由207个降为0个。由图5、6(右)可知，在真菌水平上，12个样品测序共获得324～433种水平分类的真菌(OTU)，其中共有OTU为446个，特异性OTU为3～122个，与CK相比，除ZLB第2组数据外，其余处理均降低了真菌OTU总量和特异性OTU数量，且DLB的处理效果最明显，其中CK第一组数据OTU为375个，DLB第一组数据OTU为324个，降低了13.6%，CK的特异性OTU为122个，DLB的特异性OTU为3个，与CK相比降低了97.54%。

2.5 各处理群落Beta多样性研究 Beta多样性(Beta diversity)分析用于比较不同样品在物种多样性方面的相似程度。通过主坐标分析(PCoA)可实现多个样品的分类，进一步展示样品间物种多样性差异，样品的群落组成越相似时它们在PCoA图中的距离越接近。Heatmap是基于距离算法(binary、bray、weighted、unweighted)得到样品间的距离矩阵，颜色梯度由蓝色到红色表示样品间距离由近到远，可根据颜色梯度的变化直观看出两两样品间的差异性。

由图5可知，在细菌和真菌水平上，3种贝壳粉处理组与CK组在图中的距离大，处理组组间距离相对较小，说明处理组与CK组的微生物群落差异大，处理组间的微生物群落差异小。

图4 土壤样品细菌(左)、真菌(右)OTU多样性分析Fig.4 Diversity analysis of bacteria (left) and fungi (right) in soil samples韦恩图中的不同颜色代表不同处理，韦恩图中间的数字代表所有样品共有的OTU数目，非交叠部分为各样品特有OTU个数The number in the middle of the Venn figure represents the number of OTU common to all samples, the non-overlapping part is the specific number of OTU of each sample.

图5 土壤样品细菌(左)、真菌(右)主坐标分析Fig.5 Principle coordinate analysis of soil sample bacteria (left) and fungi (right)

由图6可知，样品横向聚类后，从CK组到贝壳粉处理组，颜色由蓝色变为红色，CK组与处理组颜色差异显著。样品纵向聚类后，从CK组到贝壳粉处理组，颜色由红色变为蓝色，CK组与处理组颜色差异显著。说明CK组与处理组之间距离远，处理组组内距离小。即在细菌和真菌水平上，3种贝壳粉处理均与CK存在显著差异，不同贝壳粉处理间差异不大。表明贝壳粉调理剂处理可使酸化土壤中的微生物发生显著变化。

2.6 不同处理样品菌群相对丰度组成分析 根据物种注释及分类学分析，将OTU的代表序列与微生物参考数据进行比对，可得到每个OTU对应的物种分类信息，进而在各分类水平(phylum、class、order、family、genus、species)统计各样品群落组成。为了更直观的查看在各分类水平上相对丰度较高的物种及其比例，只选取每个样品或分组在各分类水平上最大丰度排名前十的物种，以柱状图展示，以科分类水平的物种相对丰度柱状图为例，如图7所示，各菌群相对丰度百分比如表4所示。

在细菌水平，由图7(左)得知，丰度较高的前十个科分别为鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、ABS-19科、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadales_Incertae_Sedis)、厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)、Solibacteraceae科(亚基3)(Solibacteraceae_[Subgroup_3])、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、泉发菌科(Chitinophagaceae)。与其他处理相比，CK的优势细菌类群为酸杆菌科和Solibacteraceae科，3种贝壳粉处理均显著降低了CK的2种优势类群的相对丰度，其中XLB和ZLB分别最大幅度降低了酸杆菌科和Solibacteraceae科的相对丰度，降低幅度为98.86%和71.43%，ZLB和XLB以最大幅度分别提高了CK中相对丰度较低的ABS-19科和黄色单胞菌科的相对丰度，与CK相比分别提高了16.22倍和3.35倍。

图7 土壤样品细菌(左)、真菌(右)科分类水平上的相对丰度Fig.7 A histogram of relative abundance at the familyclassification level of bacteria (left), fungi (right) in soil samples图中一种颜色代表一个物种，色块长度表示物种所占相对丰度比例； 为使视图效果最佳，只显示丰度水平前10位的物种，并将其他物种合并为 Others 在图中显示，Unclassified代表未得到分类学注释的物种。One color represents a species, and the color block length represents the relative abundance ratio of the species; for the best view, only the top 10 species of abundance level are displayed, the other species were merged into others to show that the unclassified species represented the species which had not been annotated in taxonomy.

表4 土壤样品细菌和真菌(科)分类水平各菌群相对丰度百分比Tab.4 Percentage of relative abundance of bacteria and fungi (families) in soil samples%

在真菌水平上，由图7(右)得知，丰度较高的前10个科分别为毛壳菌科(Chaetomiaceae)、小囊菌科(Microascaceae)、粪盘菌科(Ascobolaceae)、毛球壳科(Lasiosphaeriaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)、肉座菌科(Cordycipitacea)、Piskurozymaceae科、被孢霉科(Mortierellaceae)、假球壳科(Pleosporaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)。其中，CK的相对优势真菌类群有丛赤壳科、被孢霉科、假球壳科、枝孢霉科，3种贝壳粉处理均显著地降低了CK优势真菌类群的相对丰度，其中ZLB以最大幅度降低了丛赤壳科的相对丰度，降低幅度为68.93%； XLB最大幅度降低了被孢霉科的相对丰度，降低幅度为81.32%； DLB最大幅度降低了假球壳科和枝孢霉科的相对丰度，降低幅度分别为98.38%和97.25%。同时，3种贝壳粉处理极大程度的提高了CK中相对丰度较低的毛壳菌科、小囊菌科、毛球壳科和相对丰度极低的粪盘菌科。与CK相比，ZLB最大幅度提高了毛壳菌科和粪盘菌科的相对丰度，提高了12.37倍和792倍； DLB最大幅度提高了小囊菌科的相对丰度，提高了6.56倍； XLB最大幅度提高了毛球壳科的相对丰度，提高了6.47倍。

2.7 土壤处理对幼苗株高和叶绿素含量的影响 如图8所示，施加不同贝壳粉调理剂后，各处理株的高度均增大，与CK相比，在8、9月份和10月份中，XLB、ZLB、DLB均显著提高了平邑甜茶株高，3个月中各处理间无显著差异。

图8 不同粒径贝壳粉调理剂对株高的影响Fig.8 Effect of shell powder conditioners with different particle sizes on plant height不同小写字母表示同月不同处理在P<0.05水平上的差异Different lowercase letters in the figureare significantly different among different treatments in the same month at P<0.05 level.

如图9所示，施加不同粒径的贝壳粉调理剂后，各处理的叶绿素相对含量均升高，与CK相比，8月和10月XLB、ZLB、DLB均显著提高了叶片叶绿素的相对含量，9月除XLB外的ZLB、DLB均显著提高叶片叶绿素相对含量。3个处理间在9和10月之间无显著差异。

图9 不同粒径贝壳粉调理剂对叶片叶绿素相对含量的影响Fig.9 Effect of shell powder conditioners with different particle sizes on relative content of chlorophyll in leaves不同小写字母表示同月不同处理在P<0.05水平上的差异Different lowercase lletters in the figure are significantly different among different treatments in the same month at P<0.05 level.

3 讨论

本研究在原始pH值为5.45的酸化土壤中施加不同粒径的3种贝壳粉调理剂(DLB、XLB、ZLB)均可显著提高土壤pH值到6.5～7.2的范围，提高幅度19.27%～32.11%，以XLB处理的最高，这是因为贝壳粉中的碳酸钙粉末是亲水性无机化合物,其表面有亲水性的羟基, 从而呈现出较强碱性(赵耀明等2009)，能够中和土壤酸度。

高通量测序结果表明，加入贝壳粉后，土壤中微生物变化显著，3种贝壳粉处理显著提高了细菌的丰富度和多样性，增加了细菌总OTU数量，降低了酸化土壤中特异性细菌OTU数量； 降低了真菌的多样性，降低了酸化土壤中真菌的特异性OTU数量，各处理对真菌的丰富度无显著影响，各处理(除ZLB第2组数据外)均降低了真菌OTU总量，这与各处理相对丰度分析结果一致。有研究报道，土壤微生物类群由细菌主导时，可在一定程度上降低植物遭受病原菌侵害几率(Marschneretal., 2001)。各处理物种的相对丰度结果显示，3种贝壳粉处理均显著降低了酸化土壤中细菌和真菌的劣势类群，提高了酸化土壤中细菌和真菌的优势类群。与3种贝壳粉处理相比，在细菌水平上，CK的优势细菌类群为酸杆菌科和Solibacteraceae科，是酸杆菌门的2类细菌，酸杆菌门大多是嗜酸菌(Jonesetal., 2009)。在酸化土壤中加入贝壳粉后因土壤pH值升高，抑制了酸杆菌科和Solibacteraceae科细菌的大量繁殖。CK的劣势细菌类群为ABS-19科和黄色单胞菌科。黄色单胞菌科属变形菌门，变形菌门为土壤中的有益菌，且数量大，多样性高。有研究表明，变形菌门可参与各种有机物的碳氮循环，代谢类型多样，还可作为生物治理因子代谢环境中的化学污染，如甲苯(O’Mahonyetal., 2005)。本试验表明加入贝壳粉可提高土壤中黄色单胞菌科的相对丰度，从而一定程度上促进有机物的碳氮循环过程(刘守龙， 2006)。因此，施加贝壳粉调理剂有利于土壤中小分子有机营养物质增多，从而促进植物的养分吸收和生长发育。在真菌水平上，CK的优势真菌类群为丛赤壳科、被孢霉科、假球壳科、枝孢霉科。假球壳科、枝孢霉科和丛赤壳科隶属于子囊菌门，丛赤壳科隶属肉座菌目，寄生的子囊菌可引起植物病害，如： 根腐、茎腐、果腐、枝枯、叶斑等(周玉霞等， 2014)。被孢霉科是接合菌亚门的一科真菌，土壤中的接合菌门的比例会随着连作年限增加而逐年增加(赵帆等， 2017)。加入贝壳粉调理剂会在一定程度上降低土壤酸化引起的植物病害发生几率。CK的劣势真菌类群为毛壳菌科、小囊菌科、毛球壳科和相对丰度极低的粪盘菌科。毛壳菌科中的毛壳菌是极有发展潜力的生物防治真菌，毛壳菌通常存在于土壤和有机肥中，是子囊菌纲的最大属中的一个，可有效降解纤维素和有机物，因此毛壳菌成为植物病原菌的生物防治菌并被广泛应用(黄芩等， 2018； 刘守安等， 2005)。小囊菌科、毛球壳科和粪盘菌科均隶属于子囊菌门，且均腐生在粪、土、腐木、腐烂植物等基物上(李静等， 2012； 罗国涛等， 2013)。加入贝壳粉后通过提高酸化土壤的pH值，抑制嗜酸菌的大量繁殖，从而改善土壤环境，提高土壤肥力等，并促进土壤中有益微生物的数量与多样性的增加(张玲玉等， 2019)。

本试验表明，3种贝壳粉调理剂的施用，均能显著提高作为衡量植物生长质量的重要指标的株高(周玲莉等， 2010)和作为反映叶片生理活性的重要指标的叶绿素含量(李恕艳等， 2017)，且各处理间无显著性差异。说明施加贝壳粉可一定程度地提高叶片光合能力，从而提高叶片积累有机物的能力和促进植物生长(卢振兰等， 2011)。万青等(2019)在酸化茶园施用调理剂后表明可提高土壤pH值，显著提高茶叶的发芽密度、百芽重等。陈士更等(2019)研究表明，腐植酸土壤调理剂可提高果园土壤pH值，提高果实产量与品质，与本研究结果一致。土壤pH值增加能抑制土壤中有害重金属的生物活性(张玲玉等， 2019)， 还能增加土壤中有益微生物的数量与活性，使酶代谢活跃，加快土壤养分转化及提高微量元素的有效性，利于植物的吸收，从而促进植物生长(王富国等， 2011； 翟辉等， 2016)。

4 结论

施加不同粒径的贝壳粉土壤调理剂，均可提高土壤的pH值，增加植物株高和叶片叶绿素相对含量，并改变土壤中细菌的丰富度和多样性、真菌的多样性、科分类水平上的细菌和真菌的相对丰度。其中，ZLB处理可显著提高细菌丰富度和多样性，降低真菌多样性，降低细菌中Solibacteraceae科的相对丰度，提高细菌中ABS-19科的相对丰度，降低真菌中丛赤科的相对丰度，提高真菌中毛壳菌科和粪盘菌科的相对丰度。XLB处理可最大幅度的提高土壤pH值，降低细菌中酸杆菌科的相对丰度，提高细菌中黄色单胞菌科的相对丰度，降低真菌中被孢霉科的相对丰度，提高真菌中毛球壳科的相对丰度。DLB处理可最大幅度的降低真菌的多样性，降低真菌中假球壳科和枝孢霉科的相对丰度，提高小囊菌科的相对丰度。贝壳粉作为一种新型绿色生物土壤调理剂，具有极大的应用与推广潜力。