旋毛虫肌幼虫期外泌体的分离和小RNA鉴定

高 欣，杨 勇，刘 蕾，刘晓雷，刘明远，白 雪

2014年，世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)根据寄生虫对人体造成的损伤以及经济损失的综合评估，将旋毛虫列为食源性寄生虫之首[1]。自Page和Owen于1835年首次在人体尸检的肌肉中发现，但到目前为止，旋毛虫的具体感染机制仍不清楚[2]。研究表明，旋毛虫虫体粗提物和排泄分泌产物能够诱导宿主强烈的Th2型免疫反应，引起宿主免疫抑制，最终建立慢性感染从而达到长期寄生[3]。大量实验证明旋毛虫虫体粗提物或排泄分泌产物中存在可调控宿主免疫细胞、参与旋毛虫与宿主的相互作用的关键分子[4]。外泌体(exosomes, EXO)是一种表面为磷脂膜的分泌小泡，几乎所有细胞都能产生，存在于生物体液中，包括腹水、胆汁、母乳等[5]。EXO携带多种生物活性物质，如蛋白质、miRNA和mRNA，EXO与靶细胞融合后，其携带的蛋白质和RNA转移到靶细胞，进而影响靶细胞的功能[6]。

研究表明，包括肝片吸虫、蛔虫、棘球绦虫等在内的很多寄生虫可以分泌外泌体作用于宿主细胞，调控宿主的基因表达和免疫反应，参与寄生虫致病过程[7]。2018年，Li Y等[8]发现弓形虫释放的EXO能够激活巨噬细胞，刺激促炎因子分泌，触发宿主免疫反应，对弓形虫感染进行局部保护。Fromm B等[9]发现肝片吸虫释放的EXO含有10个与宿主同源的miRNA，提示EXO可能干预宿主的转录机制。Eline P. Hansen等[10]发现蛔虫EXO中的miRNA可以靶向宿主体内编码免疫反应相关的细胞因子，从而调控宿主免疫反应。因此，EXO在细胞间通过传递效应分子进而介导寄生虫与宿主之间的相互作用，这些研究提示，旋毛虫也可能分泌EXO调节宿主免疫反应，从而成功寄生[11]。

本研究采用超速离心法从旋毛虫肌幼虫培养上清中成功获得EXO，并应用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析、免疫印迹以及小RNA测序对所获的EXO进行鉴定，为今后深入研究旋毛虫肌幼虫期EXO(ML-EXO)参与炎症及其他生物学过程提供基础，并为旋毛虫病的致病机制及靶向治疗提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1实验动物与旋毛虫虫种 Wistar雌性大鼠8只，体重180～200 g(吉林大学医学部动物中心)，用于旋毛虫传代保种及旋毛虫肌幼虫期外泌体的收集。中国河南猪旋毛虫分离株T.spiralis(ISS534)由本室传代保种。

1.1.2主要试剂 胃蛋白酶、盐酸均购于中国惠世生化试剂有限公司，RPMI-1640培养基、10 000 U/mL青霉素、10 000 U/mL链霉素、胎牛血清均购于Gibco公司，戊二醛、磷钨酸均购于无锡市江原实业技贸总公司，BCA试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，兔抗鼠CD63多克隆抗体、山羊抗鼠Enolase多克隆抗体均购于Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、驴抗山羊IgG均购于Cell Signaling公司，Tru Seq小RNA文库制备试剂盒购于Illumina公司。

1.2 方 法

1.2.1旋毛虫肌幼虫的收集 取8只Wistar大鼠，经口感染3 500条旋毛虫肌幼虫，于感染后35 d(dpi)脱颈处死，去其皮肤、脂肪、四肢、内脏等。在显微镜下观察膈肌，确定有旋毛虫肌幼虫后，将胴体和膈肌绞碎，放入人工消化液(10 mL/L浓盐酸和10 g/L胃蛋白酶)中，在37 ℃下恒温消化2 h。液体过筛网并自然沉淀1 h，加入清水洗涤直至液体清亮，收集旋毛虫肌幼虫[12]。

1.2.2旋毛虫肌幼虫期外泌体的提取 本实验采用超速离心法提取旋毛虫肌幼虫期EXO(ML-EXO)。将旋毛虫肌幼虫用含5%双抗(10 000 U/mL青霉素、10 000 U/mL链霉素)的无血清RPMI-1640培养基清洗5次后，置于37 ℃、5% CO2培养箱中用800 mL含2%双抗的RPMI-1640培养基培养12 h。收集旋毛虫肌幼虫培养液，分装于50 mL离心管中，首先于4 ℃下800 g离心15 min，去除虫体。取上清置于新的离心管中，于4 ℃下5 000 g离心15 min以去除杂质。收集上清，使用0.22 μm过滤器过滤后转移到10 kDa超滤管中进行超滤，4 ℃下5 000 g离心15 min。所得上清于4 ℃下120 000 g离心2 h，弃去上清，沉淀即为ML-EXO[13]。100 μL PBS重悬EXO，—80 ℃保存，以备后续使用。

1.2.3透射电子显微镜观察旋毛虫肌幼虫期外泌体形态 采用透射电子显微镜的方法对ML-EXO形态进行检测。将纯化后的EXO在PBS中重悬后，取10 μL ML-EXO悬浮液置于铜网，静置1 min后，用滤纸将液体吸去，采用3%磷钨酸钠溶液室温负染2 min，室温风干，置于透射电子显微镜(Hitachi H-7650)下观察ML-EXO形态，在80 kV下调节亮度及焦距进行图像采集[14]。

1.2.4纳米颗粒跟踪分析法检测旋毛虫肌幼虫期外泌体大小 将ML-EXO沉淀用1 mL PBS重悬制成1 mL 0.5 g/L的溶液，经0.22 μm滤器过滤后置于冰上。按照纳米颗粒跟踪分析仪(Nanno Sight NS3000)操作流程，调整参数，检测EXO的粒子数目、浓度以及粒径分布，收集并保存数据[15]。

1.2.5蛋白免疫印迹法检测旋毛虫肌幼虫外泌体的CD63和Enolase蛋白水平 通过BCA测定ML-EXO浓度，将其充分裂解，进行10% SDS-PAGE电泳分离蛋白质，每孔上样30 μg蛋白质。电泳结束后转膜，5%脱脂奶粉封闭。然后加入兔抗鼠CD63(1∶1 000)、山羊抗鼠Enolase多克隆抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜，使用1×TBST缓冲液洗3次。再分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶2 000)、驴抗山羊IgG(1∶50 000)，室温孵育2 h，使用1×TBST缓冲液洗3次，加入化学发光显色液，应用凝胶成像分析进行分析[16]。

1.2.6旋毛虫肌幼虫外泌体中小RNA的高通量测序 采用Trizol方法从ML-EXO中提取总RNA，采用Agilent 2100系统分析RNA质量[17]。使用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离18～30 nt之间的小RNA，使用Tru Seq小RNA文库制备试剂盒构建小RNA文库。经检测合格后的小RNA，在Illumina HiSeq2000测序仪上进行测序分析。本研究的小RNA文库构建和测序均由深圳华大基因公司完成。

对原始测序数据，首先去除测序质量较低、不确定碱基大于10%、5′接头污染、无插入片段、无3′接头、包含polyA、小于18 nt的片段，得到clean reads。通过blast或bowtie将clean reads和miRBase、GenBank、Rfam数据库比对，鉴定出与数据库中完全匹配的小RNA。将测序后的小RNA进行分类注释，包括rRNA、snRNA、tRNA、miRNA等。对于miRNA的分析，通过targetscan和miRanda软件，预测miRNA的靶基因，应用GO功能和ggplot2分析研究靶基因的生物学功能。

2 结 果

2.1旋毛虫肌幼虫期外泌体形态学观察 将超速离心法分离纯化获得的ML-EXO，置于40 000倍透射电子显微镜下观察，可见EXO呈典型的椭圆形或圆形的杯状形态，具有明显的膜结构，其腔内有低密度颗粒，背景清晰，无污染，符合EXO在透射电子显微镜下的特征(图1)。利用纳米颗粒跟踪分析法对所提取ML-EXO的粒径进行检测，做出分析报告(表1)。其中直径80～200 nm约占83%，200～300 nm约占12%，300～500 nm约占5%，可以看出ML-EXO大多数处于80～200 nm直径范围。

2.2Western blotting检测旋毛虫肌幼虫期外泌体特异性标记物 采用免疫印记法，对旋毛虫肌幼虫及其EXO进行检测，结果显示旋毛虫肌幼虫及其EXO均表达特异性标记蛋白CD63和Enolase，大小分别是43 kDa和49 kDa(图2)。

图1 透射电子显微镜观察旋毛虫肌幼虫期外泌体的形态特征Fig.1 Morphological characterization of T. spiralis muscle larvae exosomes under TEM

表1 旋毛虫肌幼虫期外泌体不同大小的百分比
Tab.1 Percentage ofT.spiralismuscle larvae EXO in various size range

Particle size/nmnumber %0-80080-20083200-30012300-5005500-10000

图2 蛋白质免疫印迹法检测旋毛虫肌幼虫期外泌体特异性标记蛋白CD63和Enolase蛋白表达Fig.2 Expression of specific markers CD63 and Enolase in T. spiralis muscle larvae EXO by western blotting

2.3旋毛虫肌幼虫期外泌体的小RNA分析 将所有ML-EXO中的小RNA与各类RNA的比对、注释情况进行总结。结果发现，在ML-EXO小RNA文库中，来源于编码蛋白质的内含子和外显子共6 764种，约占小RNA的0.55%，表明总RNA质量完好，基本没有降解。各类非编码小RNA共206 120种，占小RNA的16.64%，其中rRNA的比例最高，占12.80%。未注释的小RNA共959 200种，占小RNA的77.45%，这部分序列可能是新小RNA序列，其分类和功能值得进一步研究(图3A)。通过将小RNA和miRBase数据库比对，鉴定出已知miRNA共66 352种，占小RNA的5.36%。对已知miRNA用多个软件进行靶基因预测，发现靶基因数量为34 437个(表2)。为了确定预测的靶基因行使的主要生物学功能，本研究通过GO富集分析靶基因的功能分类体系，发现在细胞、生物学调节、代谢等过程中，靶基因显著富集(图3B)。进一步利用ggplot2对丰度前50的miRNA的靶基因进行功能预测，发现其参与了多种免疫调节如MAPK级联反应、JNK级联反应和B细胞活化等过程(图3C)。

A为小RNA的种类；B为miRNA的GO功能分析；C为miRNA对免疫相关靶基因的调节分析图3 旋毛虫肌幼虫期外泌体中的小RNA分析Fig.3 Small RNA analysis in T. spiralis muscle larvae EXO

表2 旋毛虫肌幼虫期外泌体中的miRNA靶基因预测统计
Tab.2 Summary ofT.spiralismuscle larvae EXO miRNA target prediction

softwaremiRNA numberTarget gene numberCount of miRNA::corresponding target geneTarget location numbertargetscan12793485936623184265265miRanda12703451025789063055763Result126634437986331—

3 讨 论

2013年，Rothman、Schekman和Sudhof对外泌体(EXO)运输调节机制的研究获得诺贝尔生理或医学奖。自此，EXO成为研究热点[18]。旋毛虫是一种重要的食源性寄生虫，严重危害公共卫生安全，但关于旋毛虫肌幼虫期EXO的研究尚未报道[19]。目前分离EXO的方法很多，常用的有超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、超滤法等[20]。超速离心法是分离EXO的常用方法，已被广泛应用于各种EXO的分离，主要依据粒子密度和大小设置离心力，一般为高速离心和低速离心配合，可获得较高纯度的EXO，具有操作简单、不易污染等优点，因此是EXO提取的金标准[21]。我们通过超速离心法分离旋毛虫肌幼虫培养12h后的上清，在透射电子显微镜观察发现，旋毛虫肌幼虫期外泌体(ML-EXO)呈球形，与EXO的经典形态相似。纳米颗粒追踪技术原理是对每个颗粒的布朗运动进行跟踪和分析，结合Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度，该技术的样本处理简单，能保证EXO原始状态，检测速度快，已成为鉴定EXO的方法之一[22]。采用纳米颗粒追踪技术检测到ML-EXO直径在80～200 nm之间。EXO的标记物有CD9、CD63、CD81、Enolase等，其中CD63是一种保守的四聚体跨膜蛋白，直接参与了EXO内容物的分选，Enolase则参与EXO的合成过程[23]。因此，本研究检测了ML-EXO CD63和Enolase的表达，均为阳性。这些结果表明我们成功分离获得了旋毛虫肌幼虫期EXO。

miRNA可以通过EXO从寄生虫传递到宿主细胞，从而调节靶基因的表达，参与寄生虫与宿主的相互作用，因此，鉴定EXO中的miRNA为研究寄生虫病的发病机制和药物靶点开辟了新的途径[24]。Let-7是蠕虫中发现的第一个miRNA，同时也出现在寄生虫EXO中，可下调宿主的免疫反应，miRNA还与寄生虫的生长发育有关，miR-277和miR-4989可通过介导信号通路参与血吸虫的发育[25]。本研究通过targetscan和miRanda软件，在ML-EXO中鉴定了1 266种miRNA。研究miRNA功能的前提是确定其靶基因，然而，由于互补的序列较少，使得对miRNA靶基因预测的准确性较低[26]。但是对miRNA与靶基因的研究发现它们的作用有一定规律，预测一个靶基因的决定因素为miRNA的5′端有6～8个核苷酸可以与靶基因mRNA的3′端精确互补，这6～8个核苷酸称为“种子序列”[27]。因此，miRNA靶基因预测主要用种子序列的互补程度和miRNA与相应靶基因结合的稳定性作为基础[28]。基于这些原则，人们开发miRNA靶基因预测软件有Targetscan、miRanda等[29]。Targetscan软件基于miRNA的种子序列与靶基因序列互补，而miRanda软件基于miRNA与相应靶基因结合的稳定性。因此，这些软件的算法和侧重点有区别，对预测同一个miRNA靶基因也有偏差[30]。所以，我们用Targetscan和miRanda软件进行预测，取交集作为预测结果，结果表明，miRNA的靶基因数量有34 437个，靶基因预测结果还需进一步验证。在miRNA靶基因的GO富集分析中，ML-EXO中miRNA的靶基因富集到细胞过程、生物学调节、代谢过程等过程中，这表明EXO中miRNA的靶基因在细胞过程、生物学调节、代谢过程中发挥重要作用。寄生虫对宿主的免疫调节作用是通过寄生虫和宿主之间遗传信息的传递形成的，因此，寄生虫miRNA在调节宿主免疫系统中发挥了重要作用，我们通过ggplot2分析，发现一些miRNA调节免疫相关的靶基因，可能是旋毛虫逃避宿主免疫防御的重要机制，这将为旋毛虫与宿主的相互作用提供新的思路。

综上所述，本研究首次证实了旋毛虫肌幼虫可分泌EXO，同时，证明了EXO中含有多种功能性小RNA，为旋毛虫EXO分离提供实验依据，也为后续ML-EXO发挥免疫调节作用等相关研究提供基础。

利益冲突：无