云南省小型兽类感染无形体的分子流行病学调查

汤 丽,邵宗体,段兴德,江佳富,贾 娜,张 云,何志海,李玉琼,刘正祥,浦恩念,陈 星,刘洪波,蒋宝贵,高子厚,杜春红

无形体又称无浆体(Anaplasma),为革兰氏阴性、专性细胞内寄生菌,依据2004年《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版),无形体与人埃立克体均归类为变形菌纲(Alphaproteobacteria)、立克次氏体目(Rickettsiaies),无形体科(Anoplasmataceae),无形体属(Anaplasma)。其成员繁多,主要包括嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophilum)、绵羊无形体(A.ovis)、边缘无形体(A.marginale)、血小板无形体(A.platys)、牛无形体(A.bovis)、中央无形体(A.centrale)和山羊无形体(A.capra)7种[1-2]。主要侵染人与动物的血细胞(粒细胞、单核细胞、红细胞和血小板),并以包涵体的形式在宿主动物胞浆中繁殖,导致人和动物的无形体病。其中A.phagocytophilum、A.capra和A.ovis变异种可对人类致病。人类、野生大型哺乳动物、家畜以及小型兽类是无形体的病原携带者和重要传染源[3],病原体通过传播媒介蜱叮咬或破损皮肤黏膜接触含病原体的血液、体液进行传播。

云南省地形及气候复杂多样,动物及植被种类丰富,被誉为“动植物王国”,其特有的地理特征和气候条件使该地区宿主动物和媒介昆虫种类多,分布广,是各种虫媒传染病的高发地区。既往资料显示,在云南曲靖市、德宏州以及横断山区的小型兽类和犬中存在无形体感染,但是还缺乏系统的流行病学资料[4-5]。为了解云南省小型兽类无形体的感染状况,本研究进行了分子生物学调查,结果如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集 2011年5月—2016年11月,在云南省22个县(市),按照不同海拔梯度和不同气候带类型、不同生境(居民区、林区和农耕区)共130个采样点,居民区采用笼日法,林区与农耕区采用夹线法捕获2 251只小型兽类。在现场实验室按形态特征对小型兽类进行种类鉴定,以是否性成熟(雄性睾丸下降明显,雌性阴道已开口)为划分成年与未成年小型兽类的标准。解剖采集脏器样本,液氮保存带回实验室进行检测。采集地分布见图1。

图1 调查采样区及检测结果分布图Fig.1 Distribution of sampling area and result of test

1.2 试剂与设备 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN Genomic DNA Kit,lot:DP304),Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)(Thermo Fisher Scientific),DL2000 DNA Marker(Takara),PCR仪(SENSO,LabCycler Gradient Fuses型),水平电泳槽(JY-SPFT型)、高通量组织研磨仪(Retsch MM400)和凝胶成像仪(Syngene)。

1.3 方 法

1.3.1 DNA提取 取小型兽类脾组织约10 mg,以高通量组织研磨仪设定参数为20次/s,1 min,研磨为细胞悬液,按照试剂盒说明书的操作步骤对样本进行DNA提取。

1.3.2 PCR扩增 采用半巢式PCR扩增无形体16S rRNA基因前半巢660 bp片段。引物:Eh-out1(5′-TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG-3′)、3-17 pan(5′-TAAGGTGGTAATCCAGC-3′)和 Eh-out2(5′-CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC-3′)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

反应条件:采用半巢式PCR,第1轮:即95℃预变性3 min,95℃变性30 s,50℃退火30s,和72℃延伸1 min 30 s,最后72℃终延伸7 min。第2轮:即95℃预变性3 min,95℃变性30 s。52℃退火30 s,72℃延伸1 min,最后72℃终延伸7 min。均为35个循环。预期片段大小为660 bp。

1.3.3 序列测定与分析 测序后登录(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行 BLAST 比对,利用MEGA6.06构建系统进化发育树并分析。进化历史推断采用Neighbor-Joining方法,进化距离采用p-distance,Bootstrap试验重复1 000次。

1.3.4 统计学分析 运用SPSS19.0软件对其进行统计学分析,采用卡方检验或Fisher精确检验,分析了解小型兽类的阳性率与海拔、性别、年龄和生境之间的关系。并采用logistic回归分析,探讨感染与相关危险因素的关系,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同地区不同小型兽类感染无形体情况及其与生境、性别、年龄的关系 分属4目9科26属52种的小型兽类2 251份样本中,共有27份扩增到约660 bp的目的片段。总阳性率为1.20%。阳性样本分别属于针尾鼹50.00%(1/2)、纹背鼩鼱12.50%(2/16)、珀氏长吻松鼠8.33%(1/12)、藏鼠兔5.66%(3/53)、白尾松田鼠5.41%(2/37)、西南绒鼠4.00%(2/50)、社鼠3.74%(4/107)、大足鼠3.57%(1/28)、斯氏家鼠2.20%(2/91)、大耳姬鼠1.85%(2/108)、中华姬鼠1.30%(4/308)和黄胸鼠0.69%(3/433),分属3目6科7属12种(见表1)。分布在德钦县、腾冲市、盈江县、勐腊县和石屏等5个县(市)的18个采样点,见图1、表2。从图1中可以看出,阳性样本主要分布于滇西北横断山脉一带。根据样本信息进行统计学分析,阳性小型兽类在林区、农耕区和居民区的阳性率分别为1.49%,0.99%和0%,差异无统计学意义(P＝0.290)。雄性小型兽类的阳性率(1.75%)高于雌性(0.68%)(P＝0.02),见表3。成年小型兽类与未成年小型兽类之间的阳性率无统计学差异(P＝0.291),见表4。在海拔＜1 500 m、1 500～2 500 m、＞2 500 m的小型兽类中,阳性率分别是0.22%,0.09%和0.89%,差异有统计学意义(P＝0.037)。logistic回归分析显示,1 500～2 500 m采样和雄性小型兽类是无形体感染的危险因素,见表5。不同调查点小型兽类无形体检测结果见表6。

表1 不同小型兽类携带无形体的检测结果Tab.1 Results of Anaplasma in small mammals of different species

表1 (续)

表2 不同景观小型兽类无形体的携带情况Tab.2 Results of Anaplasma in small mammals in different landscapes

表3 不同性别小型兽类无形体的携带情况Tab.3 Results of Anaplasma in small mammals in different gender

表4 不同年龄小型兽类无形体的感染情况Tab．4 Results of Anaplasma in small mammals from different ages

表5 不同海拔捕获小型兽类无形体的感染情况Tab.5 Results of Anaplasma in small mammals in different altitude

2.2 PCR扩增阳性产物序列分析 对阳性样本16S rRNA基因660 bp序列进行分析,结果显示变异较大,他们之间的核苷酸同源性为99%～100%。与目前已知的A.phagocytophilum比较,其核苷酸同源性为97%～100%。基于无形体16S rRNA基因660 bp序列,选取代表序列以Rickettsia rickettsii为外参照建立系统发育树进行系统发育分析,结果表明云南省小型兽类存在无形体感染,可以分为2群(图2)。其中,德钦的大部分和腾冲、盈江、勐腊、石屏的全部无形体序列均聚在一个分支。与A.phagocytophilumDog2株(CP006618)、HZ株(CP000235)、Webster株 (NR 044762)、河南株(KC470064)、美国株(KP276588)、捷克株(EU839851)、韩国株(MF351965)和挪威株(CP015376)位于同一大分支,同源性为97%～100%,其中DQ-607与Dog2株(CP006618)、HZ株(CP000235)、Webster株(NR 044762)同源性达97%,DQ-157与 Dog2株(CP006618)、HZ株(CP000235)同源性达100%;Dog2株来自犬,HZ株来源于HL-60细胞培养。而来自德钦的DQ-113等4份样本处在另一个分枝,与马拉西亚株(KU189193)位于同一分支,同源性为98%,与来自我国河南信阳长角血蜱中检测到的无形体(KY007152)有共同的祖先。是否属于新的无形体值得进一步关注。

表6 不同调查点小型兽类无形体检测结果Tab.6 Results of Anaplasma infecting small mammals in different sample locations

图2 A.phagocytophilum基于16S rRNA基因660 bp片段构建的NJ系统发育树Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on16S rRNA gene sequences of 660 bp

3 讨 论

A.phagocytophilum主要侵染宿主中性粒细胞,人类主要症状是高热,还有头痛、疲劳、肌痛等症状,对于有基础性疾病的患者,可导致多器官受累发生衰竭而死亡,是一种新发的人兽共患自然疫源性疾病[6]。人类、野生大型哺乳动物、家畜以及小型兽类是无形体的病原携带者和重要传染源[7-8]。动物宿主持续感染是维持病原体自然循环的基本条件。既往报道啮齿动物主要感染A.phagocytophilum,对于其他无形体感染报道较少。2017年10月陆群英等[9]首次报道了社鼠、黄毛鼠和青毛鼠中存在A.bovis感染。本次调查从云南省22个县(市)的3目6科7属12种的2 251只小型兽类中仅检到27份A.phagocytophilum,总阳性率1.20%(27/2 251),阳性小兽分属3目6科7属12种,证实云南省多种小型兽类中存在携带A.phagocytophilum的情况。

从近年研究来看,A.phagocytophilum最大的宿主类群是啮齿动物,家鼠和野鼠中均可检测到,其中小家鼠、褐家鼠以及白足鼠的报道居多,此外也从食虫目的部分小型兽类中检测到。在国内其他省份的大、小林姬鼠、黑线姬鼠、小花鼠、棕背、褐家鼠、社鼠、小黄腹鼠、白腹巨鼠、黄毛鼠和沙鼠等中检测到A.phagocytophilum[10-14]。在云南省的中华姬鼠、齐氏姬鼠、大耳姬鼠、克钦绒鼠、滇绒鼠、西南绒鼠、灰腹鼠、白腹鼠、大足鼠、多齿朐鼹、斯氏花松鼠存在无形体的自然感染[16]。本次调查检出A.phagocytophilum的共有12个鼠种,其中针尾鼹、纹背鼩鼱、藏鼠兔、白尾松田鼠和斯氏家鼠未见相关报道。可能与本次调查采样主要以横断山区周边的22个县(市)为主,海拔跨度较大(530～4 458 m),此区域气候类型多样,动、植物资源丰富,具有较强的生物多样性特征有关。检出阳性的样本主要来自滇西北地区的白芒雪山保护区,捕获的小型兽类种类较多,检测出A.phagocytophilum的阳性小型兽类种类也较多。

统计学分析表明,雄性小型兽类无形体的阳性率高于雌性小型兽类的阳性率,可能与雄性小型兽类活动范围更广,与蜱接触机会更多有关。按海拔高度分析,1 500～2 500 m处捕获的小型兽类的阳性率最高,检出的27份阳性样本,有20份来自此海拔高度。此区域分布的蜱种如何,携带A.phagocytophilum的情况不甚清楚。按地区分析,主要分布在德钦县、腾冲市、盈江县、勐腊县和石屏县,有较明显的地区分布。并且本项目组的另外一项研究表明,腾冲市和德钦县的家畜和犬血中也检测到A.phagocytophilum,因此推测两地可能是该疾病的潜在疫源地。提醒在滇西北2 500 m以上高海拔地区进入林区工作和活动的人员,需注意加强防护,避免遭到蜱的叮咬。

16S rRNA构建的系统发育树也表明,检出的A.phagocytophilum具有多样性特征。16S rRNA基因常被用以细菌鉴定或种属分类,16S rRNA基因序列的相似性至少达到99%才能确定一个种,至少达到95%才能确定一个属[10]。德钦DQ-113等4份样本与A.phagocytophilum的16S rRNA基因序列同源性为96%,与无形体未定种的16S rRNA基因序列同源性为98%,推测可能为无形体的新种或亚种,还需进一步调查确认。

本研究应用分子生物学的方法,证实云南省部分县(市)的小型兽类存在嗜吞噬细胞无形体感染,且宿主动物种类丰富,对当地人群的健康构成威胁。而人群和媒介蜱、其它宿主的感染和分布以及病原体特征均值得进一步加强研究。

(致谢:现场样本采集得到当地疾病预防控制中心的大力支持,在此一并致谢!)

利益冲突:无

引用本文格式:汤丽,邵宗体,段兴德,等.云南省小型兽类感染无形体的分子流行病学调查[J].中国人兽共患病学报,2019,35(9):857-864.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.088