Profilin在弓形虫侵入宿主细胞及诱导免疫应答中作用的研究进展

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刚地弓形虫是寄生于人和高等动物有核细胞的一种顶复门寄生虫，呈世界性分布，感染了世界近1/3的人口，我国感染率为5%～20%且无性别差异[1]。弓形虫可通过母婴垂直传播导致流产、胎儿畸形、死胎、智力低下等，也可以穿透血眼屏障、血脑屏障、血睾屏障导致视网膜脉络膜炎、癫痫、雄性生殖障碍等疾患。弓形虫是专性细胞内寄生原虫，通过对宿主细胞的黏附、侵入并在细胞内形成纳虫空泡(parasitophorous vacuole，PV)进行繁殖，同时借此可逃避宿主免疫识别造成潜伏感染，当机体免疫低下时则会表现明显症状。弓形虫profiin (TgPRF) 作为肌动蛋白结合蛋白可与肌动蛋白单体(G-actin)形成二聚体调节肌动蛋白的聚合，是虫体滑行侵袭细胞、逸出宿主细胞以及毒力的必需因子，TgPRF缺乏时可引起弓形虫侵入宿主细胞障碍[2]。同时，TgPRF通过TLR-Myd 88途径在激活宿主固有免疫应答中起关键作用，诱导或调节DC、NK、巨噬细胞(MФ)分泌IL-12、IFN-γ等，并通过抗原呈递进一步参与适应性免疫的激活[3-5]。本文将对TgPRF的分子结构特点及其在调控弓形虫侵入宿主细胞、诱导宿主免疫应答机制的研究进展进行阐述。

1 TgPRF的结构特征

profilin是参与调节肌动蛋白聚合的一种小分子蛋白，结构高度保守，存在于所有的真核生物。TgPRF(AAX33672)是弓形虫最重要的肌动蛋白结合蛋白之一，由163个氨基酸组成，分子量为17.5 kD，等电点为4.40，酸性氨基酸总数(Asp+Glu)共为30个，碱性氨基酸总数(Arg+Lvs)共为15个。TgPRF共形成9个β折叠，4个α螺旋，其中53个氨基酸可能形成无规卷曲连接[6-7](图1A)。之后进一步通过分子排阻色谱和多角度激光散射分析，如同多数profilin蛋白，TgPRF分子结构一面的N端和C端各有一个α螺旋，另一面也有2个α螺旋，它们之间夹有七股β折叠，这些β折叠与非顶复门寄生虫profilin相似，但其β股6、7延长，是非顶复门寄生虫profilin的近2倍并形成溶剂暴露界面，易被溶剂分子接触。TgPRF与非顶复门寄生虫profilin的显著不同区域主要集中在β股2和α螺旋3之间的31个氨基酸(37-68残基)，TgPRF在这个区域有一个强酸性环(DDDD序列)，α螺旋2和一个突出的β发夹(50-67残基)(图1B)，这些结构在顶复门较为保守，但TgPRF的这些结构序列与顶复门其他原虫也有所不同[7]。此外，有学者采用TMHMM、Bcepred、Gene Runner等程序分析显示TgPRF蛋白不存在跨膜结构；有5个亲水性区域，这些氨基酸残基倾向于暴露在蛋白表面并易被特异性抗体识别；其T/B细胞联合抗原表位为1～22、66～80和150～160位氨基酸[6]。由上可见，TgPRF有其独特的酸性环序列、β发夹结构，并推测有大量的活性表位，其在虫体生活周期和免疫应答中可能发挥重要作用。

A: 示TgPRF序列及二级结构，共163个氨基酸形成9个β折叠，4个α螺旋，蓝色框示酸性环序列，红色框示β发夹序列。B：示TgPRF三级结构，蓝色部分示特异结构—酸性环，α螺旋2及β发夹。A: The TgPRF sequence and the secondary structure, 163 amino acids form nine β fold, four α helix, blue frame shows acid ring sequence, the red box shows β hairpin sequence. B: The TgPRF tertiary structure,the blue parts shows specific structures—acid ring, α helix 2 and β hairpin.图1 TgPRF序列及结构Fig.1 Sequence and structure of TgPRF

2 TgPRF在弓形虫入侵宿主中作用

弓形虫由于缺乏鞭毛或伪足运动细胞器，其借助一种独特的滑行运动(gliding motility)侵入宿主细胞。这种滑行运动由肌动蛋白-肌球蛋白为核心的分子马达(actin-myosin motor)驱动。弓形虫入侵宿主过程主要包括黏附、侵入并在宿主细胞内形成纳虫空泡(PV)。Sibley等研究证实弓形虫速殖子顶端微线体分泌大量微线体蛋白(MIC) 使其粘附于宿主细胞膜，与棒状体分泌的颈部蛋白(RONs)一同于虫体前端与宿主细胞之间形成环形连接区域，之后依靠肌动蛋白-肌球蛋白马达迅速挤过连接区域，进入宿主细胞[8]。用细胞松弛素或促微丝聚合剂预处理弓形虫后，均可抑制速殖子的滑行运动和对宿主细胞的入侵，表明弓形虫侵入宿主细胞、跨越生物屏障和虫体逸出细胞依赖于肌动蛋白正常聚合和解聚[9]，TgPRF在维持这种动态平衡及介导细胞运动中发挥重要作用。

Profilin存在于所有的真核生物并在肌动蛋白聚合的调节中扮演多重角色。最初研究显示profilin可隔离G-actin引起微丝解聚，后来发现profilin还通过增强核苷酸的转换由ADP-G-actin到ATP-G-actin，形成profilin-ATP-G-actin二聚体并可结合Formin同源结构域1(FH1)，同时formin-FH2又结合微丝刺端(barbed ends)，以此促进肌动蛋白单体聚合到微丝上[10]。目前，关于TgPRF在弓形虫肌动蛋白调节中作用尚存争议。一种观点认为TgPRF符合上述profilin的经典作用模式。Yarovinsky等通过pull-down实验发现 TgPRF能有效结合弓形虫肌动蛋白，形成TgPRF-G-actin复合体。重组TgPRF进行体外实验，发现其可大量聚合在游离的刺端并促进微丝组装。进一步生化分析发现，当刺端被凝溶胶蛋白加帽时微丝停止聚合，而同时TgPRF在尖端(pointed ends)通过隔离G-actin引起微丝解聚。因此，在微丝未加帽时TgPRF可通过促进刺端聚合和尖端解聚作用而维持微丝的动态稳定[2]。与上述观点不同，Skillman等发现TgPRF可微弱地抑制ADP-actin到ATP-actin转换[11]，这与Kucera的结果一致[7]。同时，弓形虫formin FH1基序(motif)退化，含有较少的脯氨酸，导致其体外与TgPRF结合力较弱无法与formin免疫共沉淀[7,12]。基于以上研究，进一步通过体外聚合实验，发现在弓形虫肌动蛋白中加入等摩尔浓度的TgPRF后反而抑制formin诱导的肌动蛋白聚合，提示 TgPRF主要作用是隔离肌动蛋白而不参与微丝的组装[11]。由于弓形虫速殖子在静止和侵袭阶段可能存在肌动蛋白动力学、formins表达或调控的差异，TgPRF与G-actin结合后亦可能导致构象改变而与formin FH1结合，尚有其他蛋白参与肌动蛋白调控。因此，上述实验结果并不能准确反映虫体内部TgPRF的调控机制。尽管如此，利用四环素诱导系统消除弓形虫TgPRF表达后导致虫体滑行运动、入侵障碍；人工增加细胞内Ca2+水平可刺激弓形虫从细胞逸出，当去除TgPRF后逸出机制失效，用TgPRF-/-虫体感染小鼠存活率达到100%[2]。综上表明，虽然TgPRF在调控虫体运动中的确切机制还不明确，但其作为维持虫体内G-actin池含量的关键因子，在维持微丝正常组装中发挥十分重要的作用，是弓形虫滑行运动、入侵宿主细胞和逸出必不可少的关键蛋白。

3 TgPRF在诱导宿主免疫应答中的作用

弓形虫感染可引发宿主固有免疫与适应性免疫，激活多种免疫细胞，如树突状细胞(DCs)、巨噬细胞、淋巴细胞、NK细胞等，它们之间相互协同，分泌多种细胞因子抵抗弓形虫感染，尤其是Th1型细胞因子(IFN-γ，IL-12等)。固有免疫主要由病原相关分子模式(PAMP)与模式识别受体(PRR)结合激活。Toll样受体(TLRs)为主要的PRR成员，DCs即通过TLR-Myd88-NFκB通路在宿主识别弓形虫抗原、激活固有免疫中起关键作用[3]。Yarovinsky等报道，超声裂解并高速离心后获得弓形虫速殖子可溶性抗原(STAg)能刺激DCs分泌IL-12，同时生化分析证实STAg中的一个相对分子质量为17.5 kD小分子肌动蛋白结合蛋白，即TgPRF在此应答中起主要作用[4]。为研究TgPRF在完整虫体激活宿主免疫应答中的作用，Plattner等通过四环素诱导系统消除虫体TgPRF表达后，发现其完全丧失诱导DCs产生IL-12的能力[2]。用恶性疟原虫profilin相关基因替换TgPRF后，完全恢复弓形虫的侵袭和感染，但依然不能有效刺激体外培养的DCs或小鼠产生IL-12；相反，若细胞松弛素D处理后，弓形虫侵入细胞能力丧失，但DCs产生IL-12/23p40几乎不受影响[7,13]，表明IL-12产生是由于虫体TgPRF的诱导而与入侵细胞无关。用TgPRF分别刺激TLR11 -/- 和MyD88-/-小鼠脾DCs均未能产生IL-12p40[4,15]，IL-12可使机体免疫转向Th1极化、诱导NK细胞分泌IFN-γ，在急性及慢性感染中缺乏IFN-γ会加速虫体复制和感染动物死亡，提示TgPRF是抵抗弓形虫感染关键的抗原分子。由上可见，TgPRF可通过DCs的TLR11-MyD88 信号通路激活固有免疫，介导高水平IL-12、IFN-γ的产生。此外，随着对TgPRF结构的研究，发现其酸性环和β发夹是识别TLR11关键结构，将这些特有序列插入酵母菌profilin中足以激活TLR11信号[7]。TgPRF启动固有免疫的同时也激活适应性免疫应答。例如，采用STAg反复免疫小鼠后可诱导强大的特异性CD4+T细胞反应，提取小鼠CD4+T细胞，加入脾细胞作为抗原提呈细胞(APC)，用STAg和TgPRF刺激后产生等程度的回忆增殖反应，表明TgPRF是CD4+T细胞应答的一个优势抗原[4]。进一步用TLR11 -/-小鼠进行了类似上述的实验，发现TgPRF的回忆反应显著减弱、表达CD44的活化CD4+T细胞明显降低，同时，MyD88 -/-小鼠也未呈现对 TgPRF的回忆刺激反应。使用荧光标记的TgPRF，测定TLR11和MyD88在DC抗原摄取中的调控作用，野生型小鼠DCs细胞群含有的荧光标记细胞是任一缺陷小鼠(TLR11-/-或MyD88-/-)的5倍，表明DCs亦可作为APC以TLR11-MyD88依赖方式处理和呈递TgPRF[15-16]。Hieny等利用STAg反复免疫H2-Ab1-/-(MHC II类缺陷)和Myd88-/-的小鼠，提取CD4+T细胞后再用TgPRF刺激并进行细胞内IFN-γ染色，显示IFN-γ+CD4+T细胞减少[15]，亦导致小鼠iNOS诱导严重延迟[16]，说明TgPRF特异性免疫原性取决MyD88和MHC II类分子的双表达。其他学者也证实TgPRF在DCs的递呈需TLR11信号通路和MHC II类分子顺式识别作用[3]。总之，TgPRF通过DCs为介导不仅引起细胞因子的分泌，也提供了辅助性T细胞分化的重要信号，在促进Th1极化抗弓形虫感染中起重要作用。

4 TgPRF相关TLRs

TLR11是一种细胞内受体，将Alexa Fluor 488标记的TgPRF与原代DCs短时共培养，显示TgPRF在细胞内迅速积累且与TLR11共同定位，并且TLR11与其他胞内TLR(如TLR379)一样也依赖内质网驻留蛋白UNC-93B1[13]。由于TLR11和细胞内受体TLR12序列具有高度的同源性，因此TLR12与TLR11一样，也可识别TgPRF[17]。用ME-49虫株分别感染TLR11-/-、TLR12-/-小鼠，发现TLR12-/-小鼠更易死亡，TLR12-/-巨噬细胞受TgPRF刺激时IL-12p40水平显著降低，表明TLR12同样在TgPRF识别中发挥重要作用。Raetz等还发现，TLR11和TLR12能够形成异源二聚体，但只有TLR11能够招募MyD88形成复合体触发级联信号[18-19]。通过比较TgPRF免疫TLR11-/-、TLR12-/-、TLR11-/-TLR12-/-小鼠NK细胞产生IFN-γ的水平，发现TLR11-/-组IFN-γ水平下降，但是其他两组几乎未见IFN-γ产生[18]。以上实验表明TgPRF完全发挥免疫效应需要TLR12和TLR11的协同作用，任一个受损均弱化或者丧失其诱导IL-12及IFN-γ效应。然而，人类细胞不表达TLR11和TLR12，但一些研究已经证实了鼠体内TLR5和TLR11功能的重叠，TLR11的配体尿道致病性大肠杆菌(UPEC)同样对TLR5产生应答，反之亦然[20]。TLR5识别细菌鞭毛蛋白高度保守的表面序列[21]，该序列包括一个类似于TgPRF长度的β-发夹结构[22]。Salazar Gonzalez等用TgPRF刺激分离的人外周血单核细胞产生大量IL-12，同样条件下用TLR5单克隆抗体预处理或siRNA技术抑制TLR5基因的表达，均导致TgPRF诱导的IL-12显著减少，提示TgPRF可通过TLR5启动人体免疫应答[23]。但最近有研究结果并不支持上述观点，其用TgPRF刺激人单核细胞未能产生细胞因子[24]。因此，TgPRF在人体如何诱导免疫应答仍待进一步研究。

5 展 望

弓形虫病作为人兽共患病，在家畜及动物间传播和流行，严重威胁人类健康并对畜牧业生产造成损失。弓形虫感染机体后引起的免疫调节较为复杂，其中TgPRF是虫体入侵宿主必不可少的关键蛋白，同时通过TLR-MyD88 信号通路激活宿主固有免疫与适应性免疫，从而增强宿主对弓形虫的抵抗。TgPRF与艾美球虫profilin高度同源，用艾美球虫的profilin作为佐剂与弓形虫抗原经腹腔或鼻内途径免疫小鼠，可增强宿主免疫应答[25]。有学者在自体肿瘤细胞疫苗中加入纯化的TgPRF作为免疫佐剂接种小鼠，发现TgPRF增强骨髓巨噬细胞(BMMs)抗原呈递能力和共刺激分子表达，并通过MyD88信号诱导IL-12和趋化因子(如CCL5，CCL12)产生，进而增加巨噬细胞吞噬肿瘤细胞能力并促进免疫细胞迁移到肿瘤部位[26]。可见，TgPRF可作为免疫佐剂在疾病防治中有广泛的应用前景。Tanaka 等将纯化TgPRF经脂质体包裹后皮下免疫小鼠，发现可诱导机体特异免疫应答，弓形虫感染小鼠的存活率增加并降低脑内包囊数[27]。综上，TgPRF即可作为疫苗备选蛋白又可作为基于TLR的疫苗佐剂诱导及增强机体免疫应答，进一步研究TgPRF在弓形虫入侵及激活宿主免疫中作用，将有助于为预防和治疗弓形虫感染提供新靶点，也为开发安全、有效的亚单位疫苗提供依据。

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