类泛素-蛋白酶体系统和药物外排泵抑制剂对结核分枝杆菌单纯利福平耐药性影响的研究

朱荟云，吴 芳，吴江东，张 杰，董江涛，章 乐，张 帅，张大龙，武青青，张万江



类泛素-蛋白酶体系统和药物外排泵抑制剂对结核分枝杆菌单纯利福平耐药性影响的研究

朱荟云1，吴 芳1，吴江东1，张 杰2，董江涛3，章 乐1，张 帅1，张大龙4，武青青4，张万江1

目的 探讨类泛素-蛋白酶体系统对结核分枝杆菌单纯利福平耐药性的影响。方法 采用刃天青显色法检测利福平对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，比较分析结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA、Mpa基因的过表达或缺失突变对结核分枝杆菌利福平MIC的差异；检测分别加入羰基氰氯苯腙、利血平、维拉帕米和氯丙嗪4种外排泵抑制剂前后各菌株对利福平MIC的影响。结果 结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的过表达均能增强单纯耐利福平结核分枝杆菌对利福平的耐药性，而Pup、Mpa、Dop和PafA基因的缺失均能显著降低单纯耐利福平结核分枝杆菌对利福平的耐药性，P值均<0.05。4种药物外排泵抑制剂能不同程度的降低各过表达菌株对利福平的MIC，P值均<0.05，并且，类泛素-蛋白酶体系统与外排泵抑制剂之间存在一定交互作用。结论 类泛素-蛋白酶体系统对结核分枝杆菌单纯利福平耐药性的产生有影响；类泛素-蛋白酶体系统可能通过调控外排相关通路蛋白来影响结核分枝杆菌单纯利福平耐药性的产生。

结核分枝杆菌；类泛素-蛋白酶体系统；利福平；最小抑菌浓度；药物外排泵；耐药性

结核病(Tuberculosis，TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的一种感染性疾病，也是一种人兽共患病。半个世纪前由于使用了抗结核药物,结核病疫情得到一定的控制[1]。然而，由于耐药结核病，特别是耐多药(multi-drug resistant，MDR)结核病的出现，影响了结核病的有效治疗和控制[2]。我国结核病利福平(rifampin ，RFP)耐药率为9.63%，高于全球平均水平[3]。因此，本文将探讨研究耐利福平结核杆菌耐药机制。

2008 年，Pearce等人[4]在结核杆菌中发现了分枝杆菌蛋白酶体降解信号原核类泛素蛋白(Prokaryotic ubiquitin-like，Pup) ，结核杆菌的Pup与结核杆菌蛋白酶体组成了结核杆菌Pup-蛋白酶体系统 (Pup-poroteasome system，PPS) 。Pup在辅助因子蛋白酶体关联ATP酶(Mycobacterium proteasomal ATPase,Mpa)、蛋白酶体辅助因子A(proteasome accessory factor A,PafA)和Pup脱酰胺酶(deamidase of Pup，Dop)的辅助作用下将底物蛋白传递到蛋白酶体内进行降解或者参与广泛的调控作用。结核分枝杆菌的蛋白酶水解功能依赖ATP，这一过程对病原体的毒力是必不可少的[5]。

本课题组前期的研究结果表明，类泛素-蛋白酶体系统中的Pup基因、Dop基因、PafA基因和Mpa基因对结核分枝杆菌的耐药性有影响[6]，但是具体机制尚不明确。本研究通过应用4种不同外排泵抑制剂，调控外排泵的功能，来观察各结核杆菌菌株的MTB PPS对利福平药物敏感性的影响，探讨MTB PPS对单纯耐利福平MTB耐药性的影响及其机制，为揭示结核杆菌的耐药机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 单纯耐利福平结核杆菌临床分离株、Pup基因、Dop基因、Mpa基因、PafA基因过表达的耐利福平结核杆菌菌株(rRFP-MTB::Pup菌株、rRFP-MTB::Dop菌株、rRFP-MTB::Mpa菌株、rRFP-MTB::PafA菌株)、Pup基因、Dop基因、Mpa基因、PafA基因缺失突变的耐利福平结核杆菌菌株(RFP-MTB△Pup菌株、RFP-MTB△Dop菌株、RFP-MTB△Mpa菌株、RFP-MTB△PafA菌株)由本实验室构建、鉴定和保存。

1.2 试剂 利福平购自Sigma公司，羰基氰氯苯腙、利血平、维拉帕米和氯丙嗪购自上海信谊药厂有限公司，刃天青购自上海Aladdin有限公司，二甲基亚枫购自山西太谷化工厂，10%的醋酸购自天津市坤华化工有限公司，Tween 80购自天津化学试剂厂，生理盐水购自上海生物工程有限公司，胰蛋白胨OXOID、酵母提取物OXOID购自英国Tryptone 公司，OADC细菌增菌液、罗氏固体培养基和7H9培养基购自美国BD公司。

1.3 绘制各菌株的生长曲线分别挑取罗氏固体培养基上生长良好的RFP MTB菌株、4种MTB PPS过表达的耐利福平结核杆菌菌株(rRFP-MTB::Pup菌株、rRFP-MTB::Dop菌株、rRFP-MTB::Mpa菌株、rRFP-MTB::PafA菌株)4种MTBPPS缺失突变的耐利福平结核杆菌菌株(rRFP-MTB△Pup菌株、rRFP-MTB△Dop菌株、rRFP-MTB△Mpa菌株、rRFP-MTB△PafA菌株)单一菌落，接种于7H9液体培养基，37 ℃摇床培养，每3 d取1次菌液，测定菌液在波长600 nm处的吸光度(A)值。以培养时间为横坐标，A600值为纵坐标，绘制各菌株生长曲线，观察各菌株的生长特点。

1.4 MIC测定

1.4.1 操作程序 参考Franzblau SG方法[7]，并在此基础上稍加改进。在一次性无菌96孔培养板(1～10孔)中每孔加7H9液体培养基工作液100 μL。第1孔加适当稀释的抗结核药原液 100 μL，双倍连续稀释至第 8孔，使各孔药物终浓度为RFP8-0.06 μg/mL,第9孔为不含抗菌药物的生长对照孔。

1.4.2 MIC值 刃天青显色法检测RFP-MTB菌株、MTB PPS过表达结核杆菌菌株、MTB PPS缺失突变结核杆菌菌株MIC值。

1.4.3 药物外排泵抑制剂对各菌株MIC的影响测定 试验前，在96孔板中加入4种外排泵抑制剂，使药物外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙、利血平、维拉帕米和氯丙嗪的终浓度分别为0.05 μg/mL、6 μg/mL、64 μg/mL、4 μg/mL。4种药物外排泵抑制剂浓度参考文献[8]并根据预实验确定。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件，采用成对样本t检验，比较单纯耐利福平结核杆菌临床分离株、4种MTB PPS过表达的耐利福平结核杆菌菌株、4种MTB PPS缺失突变的耐利福平结核杆菌菌株MIC值，以P<0.05为差异有统计学意义。采用析因设计，分析在加入不同浓度羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanidem-chlorophenyl hydrazine，CCCP)、利血平(reserpine，RP)、维拉帕米(verapamil，VP)和氯丙嗪(chlorpromazine，CPZ)上述各菌株MIC值，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各菌株的生长曲线 RFP-MTB菌株培养3 d后即进入对数生长期，培养24 d后进入生长稳定期。rRFP-MTB::Pup菌株、RFP-MTB△Pup菌株、rRFP-MTB::Dop菌株、RFP-MTB△Dop菌株、rRFP-MTB::Mpa菌株、rRFP-MTB△Mpa菌株、rRFP-MTB::PafA菌株、rRFP-MTB△PafA菌株培养6 d后即进入对数生长期，培养24 d后进入生长稳定期。rRFP-MTB::Pup菌株、RFP-MTB△Pup菌株、rRFP-MTB::Dop菌株、RFP-MTB△Dop菌株、rRFP-MTB::Mpa菌株、RFP-MTB△Mpa菌株、rRFP-MTB::PafA菌株、RFP-MTB△PafA菌株的适应期较RFP-MTB菌株长，生长周期基本相近，为30 d左右。(图1)

a.RFP-MTB菌株、rRFP-MTB::Pup菌株、RFP-MTB△Pup菌株的生长曲线；b. RFP-MTB菌株、rRFP-MTB::Dop菌株、RFP-MTB△Dop菌株的生长曲线;c. RFP-MTB菌株、rRFP-MTB::Mpa菌株、RFP-MTB△Mpa菌株的生长曲线;d. RFP-MTB菌株、rRFP-MTB::PafA菌株、RFP-MTB△PafA菌株的生长曲线。

a.The growth curve of RFP-MTB strains,rRFP-MTB::Pupstrains,RFP-MTB△Pupstrains;b.The growth curve of RFP-MTB strains,rRFP-MTB::Dopstrains，RFP-MTB△Dopstrains;c.The growth curve of RFP-MTB strains,rRFP-MTB::Mpastrains，RFP-MTB△Mpastrains;d.The growth curve of RFP-MTB strains,rRFP-MTB::PafAstrains，RFP-MTB△PafAstrains.

图1 试验菌株生长曲线

Fig.1 The growth curve of test strains

2.2 各菌株的利福平MIC结果rRFP-MTB::Pup菌株、rRFP-MTB::Dop菌株、rRFP-MTB::Mpa菌株rRFP-MTB::PafA菌株MIC与RFP-MTB菌株MIC相比明显增高，rRFP-MTB△Pup菌株、rRFP-MTB△Dop菌株、rRFP-MTB△Mpa菌株、rRFP-MTB△PafA菌株MIC与RFP-MTB菌株MIC相比差异均具有统计学意义(P<0.01)。(图2)

a. rRFP-MTB::Pup菌株、RFP-MTB△Pup菌株MICs与单纯耐利福平的MTB MIC的比较；b. rRFP-MTB::Dop菌株、RFP-MTB△Dop菌株MICs与单纯耐利福平的MTB MIC的比较；c. rRFP-MTB::Mpa菌株、RFP-MTB△Mpa菌株MICs与单纯耐利福平的MTB MIC的比较；d. rRFP-MTB::PafA菌株、RFP-MTB△PafA菌株MICs与单纯耐利福平的MTB MIC的比较**与对照组MIC比较，P<0.01a. Comparison of rRFP-MTB::Pup strains,RFP-MTB△Pup strains and the RFP-MTB MICs resistance to rifampin;b. Comparison of rRFP-MTB::Dop strains, RFP-MTB△Dop strains and the RFP-MTB MICs resistance to rifampin;c. Comparison of rRFP-MTB::Mpa strains, RFP-MTB△Mpa strains and the RFP-MTB MICs resistance to rifampin;d. Comparison of rRFP-MTB::PafA strains, RFP-MTB△PafA strains and the RFP-MTB MICs resistance to rifampin;** compared to the control MIC, P<0.01图2 各菌株MICs与单纯耐利福平的MTB MICs的比较Fig.2 Comparison of different strains and the RFP-MTB MICs resistance to rifampin

2.3 4种外排泵抑制剂对各过表达菌株的利福平MIC的影响 CCCP的终浓度为0.05 μg/mL时，利福平对RFP-MTB的MIC由2.0 μg/mL降低至0.075 μg/mL。RP的终浓度为6 μg/mL时，RP对RFP-MTB的MIC由2.0 μg/mL降低至0.9 μg/mL。VP的终浓度为64 μg/mL时，利福平对RFP-MTB的MIC降低至0.3 μg/mL。CPZ的终浓度为4 μg/mL时，利福平对RFP-MTB的MIC由2.0 μg/mL降低至1.2 μg/mL。在使用4种外排泵抑制剂之后，利福平对rRFP-MTB::Pup、rRFP-MTB::Dop、rRFP-MTB::Mpa、rRFP-MTB::PafA的MIC都有所降低。与RFP-MTB菌株相比，Pup基因过表达可以使利福平的MIC由2.0 μg/mL升高至3.6 μg/mL，在加入外排泵抑制剂之后，利福平的MIC降低，最低为0.113 μg/mL。与RFP-MTB菌株相比，Dop基因过表达可以使利福平的MIC升高至7.2 μg/mL，在加入终浓度为0.05 μg/mL的RP时，利福平的MIC可降低至0.15 μg/mL。Mpa基因过表达可以使利福平的MIC升高为3.4 μg/mL，在使用外排泵抑制剂之后，利福平的MIC最低可降至0.225 μg/mL。PafA基因过表达可以使利福平的MIC显著升高，在加入外排泵抑制剂之后，利福平的MIC也出现不同程度的降低(图2、图3)。通过SPSS析因分析，发现Pup基因、Mpa基因、Mpa基因、PafA基因与CCCP、RP、VP和CPZ 4种外排泵药物之间，存在一定的交互作用。

注： *与对照组MIC比较，P<0.05Compared to the control MIC,P<0.05图3 4种外排泵抑制剂对过表达各菌株的利福平MIC值Fig.3 Four kinds of efflux pump inhibitors on expression of various strains of rifampin MICs value

3 讨 论

原核生物分枝杆菌属中广泛存在一种类似真核生物泛素-蛋白酶体系统的蛋白降解系统，命名为类泛素-蛋白酶体系统。在类泛素-蛋白酶体系统中，通过辅助因子的作用，Pup可标记多种功能蛋白，并介导被标记的蛋白通过蛋白酶体降解。其中标记的靶蛋白广泛参与了信号通路等细菌生命活动的各个环节，多个与此系统相关基因的突变会导致结核分枝杆菌对NO的敏感性增加，同时降低了结核分枝杆菌的存活率。

Pup-蛋白酶体系统选择性降解蛋白质的过程：Pup侧链末端的谷氨酰胺在连接作用之前首先被Dop脱去酰胺基后变成谷氨酸(此过程需要与ATP的结合但不是其水解作用)[9],然后在PafA的催化下谷氨酸的1个羧基通过异肽键连接到底物赖氨酸上。与底物的赖氨酸相连接的可能是α-羧基也可能是γ-羧基(此过程需要ATP的水解作用)[10]。最后,MTB蛋白酶体的Mpa负责将底物运载到蛋白酶体内使其降解[11]。Pup羧基末端的螺旋部分会与Mpa氨基末端卷曲螺旋区域相互作用[12]。Chen X等[13]发现，PafA在PPS系统中可自动调节，自身可发生pup化。

本研究结果显示，与单纯耐利福平MTB相比，过表达Pup、Dop、PafA和Mpa基因均能够使单纯耐利福平的结核杆菌对利福平的耐药性增强。缺失Pup基因、Mpa基因、Dop基因、PafA基因均能显著降低单纯耐利福平MTB对利福平的耐药性。据报道Pup能够对 MTB 中待降解的蛋白质进行识别和修饰，并将修饰好的靶蛋白带入蛋白酶体进行降解[14]。

CCCP是最典型的质子泵抑制剂,为一种抑制质子转运的解耦联剂，可以抑制主动外排系统能量来源的质子浓度梯度，导致转运蛋白失去能量供应，破坏外排系统的主动外排作用，表现为药物在细菌中的蓄积显著增加，恢复细菌对药物的敏感性[15]。目前CCCP已是研究外排耐药系统必不可少的工具试剂，能显著降低耐药菌的MIC，几乎成为判断主动外排系统存在的标志，但是其本身具有一定毒副作用。邹永胜等[16]研究发现，主动外排泵抑制剂 CCCP 可以使氟喹诺酮类抗菌药物对 MDR大肠埃希菌的 MIC 降低。本实验结果显示，加入CCCP终浓度为0.05 μg/mL时，实验组MIC的变化范围有不同程度的降低。通过析因分析发现PPS系统与CCCP之间存在一定交互作用，说明PPS系统可能通过影响外排泵功能发挥作用。CCCP可以阻断菌体表面蛋白能量的供应，使外排泵无法正常工作，药物不被外排而蓄积于菌体内，也有可能使得ATP依赖的MTB PPS系统无法降解相关蛋白，从而提高结核分枝杆菌对药物的敏感性。目前CCCP还没有成功应用于临床，究其原因，主要是因为使用剂量较大，副作用大，对机体存在毒性伤害。

RP为一种抗高血压药物， 对结核分枝杆菌无杀菌或抑菌作用，但它是一种细菌的外排泵抑制剂已得到证实。它属于吲哚生物碱类，主要通过 ATP 水解释能途径减少细菌能量供应，从而减少细菌对底物的外排使细菌恢复对药物的敏感性[17]。Pup和ATP蛋白水解酶体在序列上的高度保守，以及折叠Pup被诱导的结合反应，作为一种普遍的识别机制，存在于细菌的蛋白酶体系统中。2013年，周云等[18]在体外用4种外排泵抑制剂对鲍曼不动杆菌的耐药性进行实验，发现对细菌耐药有明显的逆转作用。有关报道，利血平对于MFS及ABC型外排泵具有抑制作用。本实验中，外排系统与PPS系统存在交互作用，可能是因为MTB PPS降解过程中需要ATP的参与。

VP是罂粟碱的衍生物，是一种质子梯度依赖泵抑制剂，也是一种钙离子通道阻滞剂。苏启表等人[19]的研究结果显示，在脂多糖诱导产生的全身性急性炎症状态下，以上2个步骤均参与了大鼠肝P-gp的翻译后修饰过程。本研究结果显示，PPS系统与维拉帕米之间存在一定的交互作用，提示可能PPS系统调控了有关外排通路。张志刚等人[20]提出，外源性野生型泛素基因转染肿瘤细胞及应用糖化抑制剂抑制P-gP蛋白糖化过程均可增加P-gP的泛素化和蛋白降解，反之应用蛋白酶体阻断剂则可减少P-gP降解，使已泛素化的P-gP增加。同时，泛素化增强可使肿瘤细胞P-gP功能下降及其对抗肿瘤药物敏感性增强。但维拉帕米在作为外排泵抑制剂使用时所需剂量较高，容易发生心血管系统的不良反应，从而限制了其临床应用。加入维拉帕米后，MTB PPS系统的MIC值发生显著降低，提示P糖蛋白可能参与MTB的外排转运过程。

CPZ属于吩噻嗪类药物，是一种强效的抗焦虑和抗抑郁药物。甲硫达嗪作用机理同氯丙嗪。Daniel等[21]在实验中发现吩噻嗪类化合物能抑制抗凋亡基因 NF-κB。王骞等人[22]的研究表明，NF-κB途径参与结核炎症反应。提示，MTB PPS系统可能通过调控相关通路,影响细菌耐药性。

细菌对进入菌体的抗生素进行主动外排作用是细菌产生耐药性的一个重要机制[23]。2009 年，Festa 等[24]采用串联亲和层析和质谱分析法对 MTB 中的Pup标记蛋白进行了系统分析，共发现有55个被Pup标记的靶蛋白，这些蛋白涉及物质中间代谢、信号通路、毒性与抗毒性因子、细胞壁和细胞膜组分等多个方面。鉴于这些Pup-蛋白酶体系统底物蛋白的生理功能，Pup-蛋白酶体系统可以通过调控蛋白质降解，在MTB的生长调控和致病性中发挥重要作用。本研究发现MTB PPS系统可能与外排泵相关，利用pupylation网站和pupdb数据库，研究探讨MTB PPS影响利福平耐药性的靶蛋白为结核病的耐药机制，疫苗的研制提供基础。

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Effects of theMycobacteriumtuberculosisprokaryotic ubiquitin-like protein-proteasome system on the mono-resistant to rifampin resistance toMycobacteriumtuberculosis

ZHU Hui-yun1，WU Fang1，WU Jiang-dong1，ZHANG Jie2，DONG Jiang-tao3，ZHANG Le1, ZHANG Shuai1，ZHANG Da-long4，WU Qing-qing4，ZHANG Wan-jiang1

(1.DepartmentofPathophysiology，ShiheziUniversitySchoolofMedicine/TheKeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseases/CollaborativeInnovationCenterofHighIncidenceofZoonosesCommunicableDiseasePreventionintheWesternRegion，Shihezi832002，China;2.EmergencySurgeryDepartment，theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversityMedicalCollege，Shihezi832002，China;3.DepartmentofNeurosurgery，theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversityMedicalCollege，Shihezi832002，China; 4.DepartmentofCriticalMedicine，theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversityMedicalCollege，Shihezi832002，China)

We studied the effect of theMycobacteriumtuberculosisprokaryotic ubiquitin-like protein-proteasome system on mono-resistant to rifampin resistance toM.tuberculosis. A resazurin-based assay was employed to evaluate minimum inhibitory concentration (MIC) and comparative research on mono-resistant to rifampin MTB withPup，Dop，PafA，Mpagenes expression and deletion of the difference. Above testing strains，respectively，carbonyl cyanide chlorobenzene hydrazone (CCCP)，reserpine (RP)，verapamil (VP) and chlorpromazine (CPZ) were tested. We compared and analyzed the change of rifampicin MICs on the various strains. Compared with rifampin resistant MTB，overexpression ofPup，Dop，PafAandMpagenes were able to make mono-rifampicin ofM.tuberculosisto enhance resistance to rifampin. Deletion ofPupgene，Mpagene，Dopgene，PafAgene significantly decreased the resistance to rifampicin alone MTB，and thePvalue was <0.05. Results indicated that 4 kinds of efflux pump inhibitors can reduce the degree of rifampin MIC in different strains. Through the factorial analysis，there were some interactions between MTB and PPS efflux pump inhibitors，and thePvalue was <0.05. MTB PPS has influence on mono-rifampin resistance to MTB and it may regulate the efflux pathway related protein to influence its resistance.

Mycobacteriumtuberculosis; prokaryotic ubiquitin-like protein-proteasome system; rifampin; minimum inhibitory concentration; active efflux; drug resistance

Zhang Wan-jiang; Email: zwj1117@126.com

国家自然科学基金资助项目(No.81260261，No.81160192)；石河子大学高层次人才科研启动项目(No.RCZX201446)

张万江，Email: zwj1117@126.com

1.石河子大学医学院病理生理学教研室/《新疆地方与民族高发病》教育部重点实验室/《西部地区高发人兽共患传染性疾病防治》协同创新中心，石河子 832002； 2.石河子大学医学院第一附属医院急诊外科，石河子 832002； 3.石河子大学医学院第一附属医院神经外科，石河子 832002； 4.石河子大学医学院第一附属医院重症医学科，石河子 832002

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.009

R378.91

A

1002-2694(2017)07-0617-07

2016-10-24 编辑：张智芳

Supported by the National Natural Science Foundation (Nos. 81260261，81160192) and the High-level Personnel Scientific Research Projects of Shihezi University (No. RCZX201446)