VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的毒力研究

陆瑶瑶，冯永杰，董 辉，杨玉荣



VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的毒力研究

陆瑶瑶，冯永杰，董 辉，杨玉荣

目的 探究VEG株弓形虫卵囊对中国昆明小鼠的致病性。方法 分别选择<1个，100个～108个的VEG株弓形虫卵囊灌胃昆明小鼠，采用MAT、H&E和IHC方法研究小鼠对弓形虫的感染情况，并分析小鼠感染率，生存率及其大脑内的弓形虫包囊数量。结果 ≥102个VEG株弓形虫卵囊可引起小鼠100%感染，最低致死剂量为102个卵囊，100%致死剂量为108个卵囊，急性期死亡时间为7 DPI～14 DPI，弓形虫的成囊率是32.14%(9/28)，包囊数量为9～857个/只小鼠大脑，感染小鼠生存率为67.44%(29/43)，最长存活时间≥390 DPI。结论 VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的毒力中等，包囊形成率较高。

VEG虫株；弓形虫卵囊；昆明小鼠；包囊；致病性

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种胞内寄生虫，分布广泛，它可以感染所有有核细胞的恒温动物，包括人类、家禽、家畜等，从而引起弓形虫病[1]。猫科动物是弓形虫的终末宿主，弓形虫可以在其体内进行无性生殖和有性生殖。几乎所有恒温动物都是弓形虫的中间宿主，吞食或饮用了被弓形虫卵囊污染的食物或水源，或者食用了未煮熟的含有弓形虫包囊的肉品[2]，弓形虫可侵入肠壁经血液或淋巴液扩散至全身各组织，若宿主免疫力正常，则虫体繁殖受阻，形成包囊；若宿主免疫力低下，或弓形虫毒力较强，数量较多，可以引起弓形虫急性感染而死亡。VEG株弓形虫是Ⅲ 型弓形虫的代表虫株，关于其对我国昆明小鼠的致病力研究，还未见报道。本试验采用改良凝集试验(Modified Agglutination Test，MAT)，常规病理学方法，苏木素与伊红对比染色法(Hematoxylin-Eosin staining，H&E)和免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)染色技术，研究VEG株弓形虫对昆明小鼠的毒力，为弓形虫卵囊入侵机制及防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 弓形虫卵囊及主要试剂 VEG株弓形虫卵囊、兔抗弓形虫多克隆抗体、弓形虫抗原受赠于美国农业部Dubey实验室，小鼠Specific HRP/DAB(ABC)Detection IHC kit 购自abcam公司(货号：ab64264)。

1.2 试验动物及处理 6～8周龄健康昆明小鼠55只，购于郑州大学实验动物中心(实验动物处理遵守动物伦理与福利相关规定)。小鼠按性别随机分为11组(每组雌雄分开，10个感染组，1个对照组)，每组5只小鼠，正常采食饮水。对照组小鼠灌胃无菌生理盐水1 mL/只，感染组小鼠分别灌胃梯度稀释的弓形虫卵囊：<1个/只，1个/只，10个/只，102个/只，103个/只，104个/只，105个/只，106个/只，107个/只，108个/只，每只小鼠灌胃卵囊溶液1 mL。接种后60 d(60 days post inoculation，60 DPI)，采集全部小鼠血清，小鼠乙醚麻醉后处死(保留105个/5只，106个/1只，107个/1只卵囊组存活的小鼠)。每天观察小鼠临床情况，记录发病和死亡情况。对感染后死亡(非处死)和处死的小鼠组织涂片观察记录肺脏、肠系膜淋巴结中弓形虫速殖子，取大脑制作组织压片观察记录大脑包囊数量；10%中性福尔马林溶液固定死亡小鼠的全部组织脏器，常规方法制作石蜡切片，H&E染色及弓形虫抗原IHC染色。

1.3 试验方法 采用MAT方法检测小鼠血清中弓形虫IgG抗体[3]。肺脏、肠系膜淋巴结中弓形虫速殖子检测采用组织涂片方法，进行显微镜观察；小鼠大脑中包囊的计数采用脑组织研磨液法，进行显微镜镜检[4]。

1.4 数据分析 采用软件GraphPad Prism 5.0 software (Graphpad Software Inc.，San Diego，CA，USA)对得到的数据进行分析，并绘图。

2 结 果

2.1 VEG株弓形虫卵囊灌胃后小鼠感染及死亡 60 DPI小鼠血清弓形虫IgG抗体结果显示，< 1个VEG株弓形虫卵囊灌胃组小鼠弓形虫感染率为0，1个和10个卵囊灌胃组小鼠的弓形虫感染率均为80%，≥102个/只卵囊灌胃组小鼠的感染率均为100%(表1)。102个，106个，107个，108个卵囊灌胃组分别有小鼠在14 DPI；10 DPI和11 DPI；9 DPI、10 DPI和13 DPI；7 DPI、8 DPI、9 DPI和11 DPI感染后死亡(非处死)(表1)。对感染后死亡(非处死)的这14只小鼠的肺脏和肠系膜淋巴结涂片，显微镜镜检可见弓形虫速殖子，见图1(A、B)。

在接种后60 DPI～390 DPI，105个，106个，107个VEG株弓形虫卵囊灌胃组分别有小鼠在212 DPI、232 DPI、264 DPI和383 DPI；227 DPI；206 DPI感染后死亡(非处死)，剩余一只小鼠存活时间超过390 DPI(表1)。试验小鼠生存曲线见图2。

2.2 VEG株弓形虫感染后小鼠大脑包囊负载量 60 DPI对处死的试验组小鼠，取大脑并研磨镜检计数，结果表明102个，104个VEG株弓形虫卵囊组小鼠的大脑研磨液中存在弓形虫包囊，每只小鼠大脑的包囊量是9～11个，包囊负载量见表1。

60 DPI～390 DPI小鼠进入弓形虫慢性感染期，105个VEG株弓形虫卵囊组感染后死亡4只小鼠(非处死)，其中3只小鼠的大脑研磨液中检出弓形虫包囊，小鼠大脑的包囊量约160个；106个和107个卵囊组分别各有1只感染后死亡的小鼠(非处死)，其大脑研磨液中均检出弓形虫包囊，包囊量分别是722个和857个。详细的包囊负载量见表1。大脑组织包囊形态见图1(C-F)。VEG株弓形虫的成囊率为32.14%(9/28)，感染VEG株弓形虫的小鼠生存率为67.44%(29/43)，最长存活时间≥390 DPI。

3 讨 论

弓形虫的宿主种类较多，感染分布范围广。不同基因型虫株的毒力有差异[5]，目前已有232个弓形虫的基因型收录在弓形虫数据库中(http://toxodb.org/toxo)。采用PCR限制性片段长度多态性分析的方法对人类和动物体内的弓形虫虫株进行基因分型，结果表明弓形虫的遗传具有多态性和地域差异性[6-8]。弓形虫基因型分类及特点：Ⅰ型为强毒株，对小鼠以及免疫抑制患者有很强的致病性，低浓度的弓形虫在急性期感染即可导致小鼠死亡；Ⅱ型和Ⅲ 型为弱毒株，致病性较弱，只有高浓度的弓形虫才可以引起小鼠死亡，低浓度的弓形虫侵入小鼠后易形成组织包囊[9]。

表1 灌胃VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的致病性

Tab.1 Pathogenicity of the VEG strain ofT.gondiioocysts onKunmingmice orally

No．ofoocystsNo．ofinfection/No．ofinoculationDaysofsurvivalNo．ofbraincystsofeachmouseNo．ofbraincystsAverage±Standarderror1085/5(100%)11/2，7/1，8/1，9/1∗/501075/5(100%)10/2，9/1，13/1，206/1∗/4，8578571065/5(100%)10/3，11/1，227/1∗/4，7227221055/5(100%)212/1，232/1，264/1，383/1，≥390/1161，340，0，141，alive160．50±139．481045/5(100%)≥60/538，17，0，0，011．00±16．791035/5(100%)≥60/50，0，0，0，0，01025/5(100%)14/1，≥60/4∗/1，9，30，0，09．75±14．15104/5(80%)≥60/50，0，0，0，-014/5(80%)≥60/50，0，0，0，-0<10(0%)≥60/5--对照组Controlgroup0(0%)≥60/5--

注：a表示小鼠存活天数/存活小鼠数目；“*/”表示急性感染期死亡小鼠/小鼠数目；“-”表示小鼠未感染

Note：a mouse survival days / number of surviving mice; “*/” mice in acute infection/ number of died mice; “-” mice were not infected

A小鼠肺脏中弓形虫速殖子，肺脏涂片，未染色，7 DPI；B小鼠肠系膜淋巴结中弓形虫速殖子，肠系膜淋巴结涂片，未染色，7 DPI；C、D、E和F小鼠大脑中弓形虫包囊，206 DPI。C和D大脑组织压片，未染色；E大脑组织切片，HE染色；F大脑组织切片，IHC 染色。标尺=50 μmA: Tachyzoites of T. gondii in the lung of mouse (arrow)，lung smear，unstained，7 DPI; B: Tachyzoites of T. gondii in the mesenteric lymph nodes of mouse (arrows)，mesenteric lymph nodes smear，unstained，7 DPI; C，D，E and F: Tissue cysts of T. gondii in brain of mouse，206 DPI. C and D Brain squash，unstained; E: Section of brain tissue，HE stained; F: Section of brain tissue，IHC stained.Bar=50 μm图1 VEG弓形虫速殖子和包囊Fig.1 Tachyzoites and tissue cysts of VEG strain T. gondii

A:灌胃VEG株弓形虫卵囊浓度梯度的昆明小鼠生存曲线(0 DPI～60 DPI)；B:灌胃VEG株弓形虫卵囊浓度梯度慢性感染期的昆明小鼠生存曲线(60 DPI～390 DPI)A: The survival curve of mice after inoculation with gradient concentration of VEG strain T. gondii oocysts orally (60 DPI-60 DPI);B: The survival curve of chronically infected mice after inoculation with gradient concentration of VEG strain T. gondii oocysts orally (60 DPI-390 DPI).图2 小鼠感染梯度浓度的VEG弓形虫卵囊后的梯度曲线Fig.2 Survival curves of mice after inoculation with gradient concentration of VEG strain T. gondii

研究发现，1个I型强毒株CT1和GT1的卵囊即可引起Swiss和BALB/c小鼠死亡[4]，RH株弓形虫以及TgCtxz1株弓形虫的一个速殖子即可感染小鼠，死亡率分别是25%和83.3%[10]。弓形虫II型和III型弱毒株感染小鼠后可在小鼠组织中形成包囊，尤其是大脑。II型弱毒株ME49和III型弱毒株VEG对Swiss小鼠口服接种组织包囊的最低感染量分别为100个包囊和10个包囊，口服100个ME49株弓形虫的包囊，大脑包囊数量约566个(54DPI)；口服1 000个VEG株弓形虫包囊可引起小鼠死亡，而皮下注射1个VEG株弓形虫的包囊可引起小鼠感染，104个虫量可导致小鼠死亡[11]。VEG株弓形虫对Swiss小鼠和BALB/c小鼠的100%最低致死量为102～103个卵囊，对HLA转基因小鼠最低致死剂量为102个卵囊，将III型的TgGoatUSA弓形虫卵囊(103个)分别灌胃Swiss小鼠，HLA转基因小鼠，IFN-γ基因敲除鼠和C57/Black小鼠，发现其在Swiss小鼠组织中形成的包囊数最高(平均457个)[4]。

在我国分离到的弓形虫活虫虫株，大部分为弱毒株，66.67%的虫株属于ToxoDB#9[12]。为了对其他弱毒虫株致病特点的研究提供参考，本研究以III型弓形虫VEG株弓形虫卵囊梯度浓度灌胃小鼠，研究其对昆明小鼠的毒力及致病性，结果显示该虫株对昆明小鼠的最低致死剂量为102个卵囊，这与已有研究的其他品系小鼠最低致死剂量基本一致。同时，本研究室对于河南首次分离到的ToxoDB#17做了致病性研究，结果发现ToxoDB#17卵囊对昆明小鼠的致病性远远低于VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的致病性[13-14]。对ToxoDB#17研究表明，1个卵囊即可引起昆明小鼠感染，但卵囊浓度的高低对小鼠的死亡率以及成囊率没有明显相关性[14]。然而，106～107个VEG虫株卵囊组的小鼠在急性感染期死亡率达到80%，108个卵囊组小鼠死亡率100%，且在感染急性期小鼠死亡时间是7 DPI～14 DPI。60 DPI，从小鼠大脑中发现包囊的最低卵囊浓度为102个卵囊，≥104个卵囊组小鼠均发现弓形虫包囊，且包囊数量随着卵囊浓度增大而增多，但与DPI无明显相关性。在小鼠进入慢性感染期之后到390 DPI，高浓度卵囊试验组(105个/只，106个/只，107个/只)的7只小鼠中感染后死亡(非处死)的6只小鼠大脑有5只发现组织包囊，包囊数平均约为370个，说明昆明小鼠对VEG株弓形虫卵囊易感，并且随着卵囊浓度的升高，小鼠死亡率以及大脑中包囊数量也增高。

综上，VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的致病性及毒力中等，与其对Swiss小鼠和BALB/c小鼠的致病特点基本一致。目前国内尚未有VEG株弓形虫对昆明小鼠毒力特点的报道，且VEG株弓形虫是一个典型的III型弓形虫，可以为其他基因型的弱毒虫株致病特点及其毒力研究提供参考，为有效防控弓形虫病以及疫苗的筛选提供理论依据。

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Virulence of VEG strainToxoplasmagondiioocysts againstKunmingmice

LU Yao-yao，FENG Yong-jie，DONG Hui，YANG Yu-rong

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

To explore the pathogenicity of VEG strainToxoplasmagondiioocysts on ChinaKunmingmice，T.gondiioocysts of < 1 and 102-108were chosen to feed the mice orally. And the modified agglutination test (MAT)，H&E and IHC were used to check the infection of mice. The infection rate，the survival rate of mice，and number of cysts in brain were analyzed. Results showed that 100% of the mice fed with ≥102oocysts were infected，the minimum lethal dose was 102oocysts and the 100% lethal dose was 108oocysts. The time of death in acute infection was 7 DPI to 14 DPI.T.gondiicysts formation rate was 32.14% (9/28)，and the number of cysts was 9 to 857 per mouse. The survival rate of infected mice was 67.44% (29/43)，and the longest survival time was more than 390 DPI. Accordingly，the virulence ofT.gondiiVEG strain is medium，and has a higher cysts formation rate.

T.gondiiVEG strain; oocysts;Kunmingmice; tissue cysts; pathogenicity

Yang Yu-rong，Email: yangyu7712@sina.com

国家自然科学基金(No.30800812)，河南省高校科技创新人才支持计划(No.17HASTIT038)，河南省自然科学基金(No.162300410138)通讯作者：杨玉荣，Email: yangyu7712@sina.com

河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.010

R382.5

A

1002-2694(2017)07-0624-04

2016-11-10 编辑：张智芳

Supported by the National Science Foundation of China (No. 30800812)，the University of Science and Technology Innovation Talent Support Program of Henan Province (No. 17HASTIT038) and Science Foundation of Henan (No. 162300410138)