人食物中毒、屠宰及市售禽肉样品中沙门菌毒力基因结果分析

牛莉娅，徐保红，蔡文华，王 燕，杨新英，郭玉梅，孙殿兴



人食物中毒、屠宰及市售禽肉样品中沙门菌毒力基因结果分析

牛莉娅1，徐保红2，蔡文华3，王 燕1，杨新英1，郭玉梅2，孙殿兴1

目的 了解石家庄地区不同来源沙门菌毒力基因携带状况，为进一步开展沙门菌风险评估提供基础数据。方法 收集石家庄地区2011年至2016年食物中毒、屠宰场鸡肉及市售鸡肉的沙门菌分离株186株，进行血清分型，对8种毒力基因(invA、sopE、agfA、spvR、hilA、stn、pefA、shdA)进行PCR检测。结果 石家庄地区不同来源沙门菌中，共检出13种血清型，以肠炎沙门菌为显著优势群，上述8种毒力基因均有检出，其中携带率较高的毒力基因为hilA、stn、invA，分别是90.3%(168/186)、86.6%(161/186)和82.8%(154/186)。结论 不同来源沙门菌的毒力基因携带状况不同。生禽食品的终端销售环节出现了较严重的污染，应采取措施加强对石家庄地区各早市流动生禽摊点储存和销售环节的食品卫生监督与防控。

沙门菌；毒力基因；血清型；生禽食品；风险评估

沙门菌(Salmonella)是引发人和动物食物中毒、胃肠炎的重要的人兽共患病原菌[1]，是世界范围内最重要的食源性致病菌之一[2-3]，也是我国食源性疾病的主要病原体[4]，具有重要的流行病学意义，被列为食品致病菌检测的一个重要对象和指标。沙门菌种类繁多，目前已知2 600种血清型[5]。沙门菌的致病性是其携带的毒力相关基因相互作用的结果，而这些毒力基因主要分布在毒力岛、菌毛、鞭毛、脂多糖和质粒等上。

毒力岛SPI-1含有inv、hil、org、spt、spa、sip、iag、iac、prg、sic等基因, 编码与侵袭力有关Ⅲ型分泌系统的成分[6]。InvA为沙门菌的主要毒力因子，该基因决定了沙门菌的侵袭力,与其致病性密切相关[7-8]。另外,在61′处还有一个单独存在的sopE基因，与宿主细胞的侵入有关[9]。HilA直接控制inv/spa操纵子的表达,且所有组成部分的产物都是分泌组织起作用所必须的[6,10-11]。肠毒素(stn)基因是沙门菌感染机制中重要的毒力因子之一，其编码产物能诱发小鼠肠腔液体分泌反应[12]，研究表明携带有stn基因的菌群表现出对多种抗生素的抵抗力[13]。在毒力质粒上，与致病性相关的spv(Salmonellaplasmid virulence)基因有6 个开放阅读框(spvA、spvB、spvC、spvD、orfE、spvR)，与沙门菌在宿主细胞内的存活和快速生长有关，其表达是依赖于spvR[14-15]。质粒的毒性是独立于宿主而存在的。Pef为质粒编码菌毛蛋白(Plasmid-encoded fimbriae)，作用是通过伴侣诱导的装配途径调节细菌对肠上皮细胞的粘附[16]。菌毛和鞭毛的共同作用，使沙门菌黏附于宿主肠道上皮细胞及在肠粘膜定植、增殖, 从而感染宿主，菌毛是位于菌体表面的纤细结构,由agfA、agfB和agfC3个亚基组成[17]。ShdA是一个大型的外膜蛋白特异性识别和结合蛋白，参与沙门菌在回肠末端淋巴结和盲肠的定植[18]。

目前公认沙门菌中毒食品主要为被污染的生禽肉、生畜肉等动物性食品[19]。本研究采集分离自石家庄地区不同屠宰场、早市流动生禽销售摊点，及2011-2016年的食物中毒事件中的沙门菌株186株，通过对毒力基因invA、sopE、agfA、spvR、hilA、stn、pefA、shdA进行PCR扩增，来调查石家庄地区沙门菌毒力基因的携带情况，为进一步开展沙门菌风险评估提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 采集2011-2016年石家庄地区9起食物中毒事件中采集到的沙门菌32株，石家庄地区2家大型屠宰场分离出的沙门菌56株，石家庄不同早市流动生禽销售摊点分离出的沙门菌98株，共计186株沙门菌。

1.2 仪器与试剂 veriti型PCR扩增仪(美国AB公司)，xcel型全自动毛细管电泳仪(德国Qiagen公司)。亚硒酸盐胱氨酸增菌液、尿素酶生化管、SS琼脂、HE琼脂(北京陆桥)，沙门显色培养基(法国科马嘉)，API 20E(法国梅里埃)，沙门菌属诊断血清(宁波天润生物药业有限公司)，5×Buffer、Taq酶、dNTP、PCR引物(大连宝生物工程有限公司)，测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.3 菌株血清型测定 参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门菌检验》GB 4789.4-2010进行血清学分型[20]。

1.4 细菌DNA模板的制备 采用煮沸法提取细菌的DNA模板，方法如下：刮取纯培养菌落至盛有200 μL无菌纯水中制成菌悬液，100 ℃煮沸10 min，冰浴5 min，然后4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，取上清液作为DNA模板，-20 ℃保存备用。

1.5 引物序列 根据文献报道，沙门菌常见的毒力基因引物序列参见表1。

表1 本研究所使用的PCR引物序列列表

Tab.1 Primer sequences used in this study

基因(gene)位置(location)引物序列(5′⁃3′)(primersequence)大小/bp(size)参考文献(references)invASPI⁃1GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA284[21]TCATCGCACCGTCAAAGGAACCsopESPI⁃1CAGACCCGTGAAGCTATACT380[22]AATTGCTGTGGAGTCGGCATagfA菌毛(Fimbriae)GGATTCCACGTTGAGCATTT312[23]GTTGTTGCCAAAACCAACCTspvR毒力质粒(Virulenceplasmid)CAGGTTCCTTCAGTATCGCA310[22]TTTGGCCGGAAATGGTCAGThilASPI⁃1TTAACATGTCGCCAAACAGC216[23]GCAAACTCCCGACGATGTATstn肠毒素(Enterotoxin)GAAGCAGCGCCTGTAAAATC405[23]GCTGACTCAGGTGCTGTTGApefA毒力质粒(Virulenceplasmid)ACACGCTGCCAATGAAGTGA450[22]ACTGCGAAAGATGCCACAGAshdA外膜蛋白(Outermembraneprotein)CTGACGTTAAGCGGCGATAA625[23]CGTCAACGTCTGTCAGTGTA

1.6 PCR反应体系与参数 PCR反应体系：25 μL：5× Buffer5 μL、dNTP 2.0 μL、Taq酶(5 U/μL) 0.25 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板0.5 μL，无菌纯水16.25 μL。反应参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，94 ℃退火1 min，55 ℃延伸1 min，共进行30个循环；72 ℃终延伸1 min。

1.7 PCR产物分析 将毛细管电泳出现阳性条带的PCR产物送上海生工双向测序，结果在GenBank进行在线比对。

1.8 统计学分析 检出率的比较用卡方检验，取P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清分型结果 186株沙门菌共分为13种血清型，其中食物中毒株为7种血清型，早市流动生禽摊点检出株中有9种血清型，屠宰场检出株中仅有肠炎沙门菌1种血清型。仅存在于早市流动生禽摊点的血清型有山夫登堡沙门菌、肯塔基沙门菌、鸡-雏沙门菌、Rissen沙门菌、Redba沙门菌、Fillmore沙门菌。详见表2。

表2 各类样品沙门菌血清型分布

Tab.2 Distribution of all samples ofSalmonellaserotype

沙门菌血清型(Salmonellaserotype)总株数(Numberofstrains)食物中毒(株)(Foodpoisoning)屠宰场(株)(Slaughterhouse)早市流动生禽摊点(株)(Rawpoultrystalls)肠炎沙门菌(Salmonellaenteritidis)124175651山夫登堡沙门菌(SalmonellaentericaserotypeSenftenberg)170017圣保罗沙门菌(SaoPauloSalmonella)4400印第安纳沙门菌(SalmonellaIndiana)183015鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)3201肯塔基沙门菌(SalmonellaKentucky)5005都柏林沙门菌(SalmonellaDublin)2200鸡-雏沙门菌(ChickenSalmonellaPullorum)1001Rissen沙门菌(SalmonellaRissen)3003Redba沙门菌(SalmonellaRedba)2002Fillmore沙门菌(SalmonellaFillmore)2002乙型副伤寒沙门菌(SalmonellaparatyphoidB)3300依麦克沙门菌(SalmonellaEmek)1100甲型副伤塞沙门菌(SalmonellaparatyphoidA)1001合计(total)186325698

2.2 沙门菌8种毒力基因检出结果 对186株沙门菌的8种毒力基因(invA、sopE、agfA、spvR、hilA、stn、pefA、shdA)进行PCR检测，8种毒力基因均有检出。携带率较高毒力基因为hilA、stn、invA，分别为90.3%(168/186)、86.6%(161/186)和82.8%(154/186)，其次为毒力基因shdA、sopE、agfA，携带率分别为62.4%(116/186)、61.3%(114/186)、56.5%(105/186)，毒力基因spvR、pefA携带率较低，为39.8%(74/186)和38.7%(72/186)。

2.3 不同来源的沙门菌毒力基因携带情况分析 8种毒力基因分别在食物中毒、屠宰场、早市流动生禽销售摊点的阳性检出结果详见表3。不同来源沙门菌中8种毒力基因也均有检出。

表3 沙门菌8种毒力基因检出情况

Tab.3 Detection of eight virulence genes inSalmonellaspecies

来源(source)菌株数(no．ofstrains)hilAstninvAsopEspvRpefAshdAagfA阳性数(株)携带率(%)阳性数(株)携带率(%)阳性数(株)携带率(%)阳性数(株)携带率(%)阳性数(株)携带率(%)阳性数(株)携带率(%)阳性数(株)携带率(%)阳性数(株)携带率(%)食物中毒(Foodpoisoning)3232100321003196．92578．12062．51959．4825．0618．8屠宰场(Slaugh⁃terhouse)564885．73969．62748．22748．2610．71017．93155．4814．3早市摊点(Rawpoultrystalls)988889．89091．89698．06263．34849．04343．97778．69192．9合计(total)18616890．316186．615482．811461．37439．87238．711662．410556．5

但不同来源的沙门菌各毒力基因携带率不同，见图1。在食物中毒株中，毒力基因hilA、stn、invA的携带率，明显较spvR、pefA、shdA、agfA的携带率高，有统计学差异。毒力基因hilA、stn、invA、sopE、spvR、pefA在食物中毒株和早市流动生禽销售摊点检出株携带率无统计学差异。毒力基因stn、invA、sopE、spvR、pefA在屠宰场检出株中的携带率低于食物中毒株，有统计学差异。毒力基因shdA、agfA在非食物中毒株中的携带率明显高于中毒株，有统计学差异。

图1 不同来源沙门菌毒力基因携带率比较Fig.1 Comparison of virulence genes carrying rate of Salmonella from different sources

3 讨 论

沙门菌是引起细菌性食源性疾病的主要病原菌，其致病性主要是由于毒力因子的作用，而不同沙门菌的毒力因子携带情况并不相同。血清分型结果显示，本地不同来源沙门菌的优势菌群均为肠炎沙门菌，与既往本地报道一致[24]。本地区2家大型屠宰场仅检出肠炎沙门菌一种血清型，而早市流动生禽摊点检出的沙门菌血清型较为多样，提示在生禽食品的终端销售环节出现了新发的沙门菌污染。本地区食品中毒株的血清型也较为分散，说明食品中沙门菌的污染具有多样性。

本研究对石家庄地区不同来源的沙门菌的8种毒力基因携带情况进行了较为系统地探究，发现毒力岛SPI-1上毒力基因hilA、invA，以及肠毒素毒力基因stn具有较高的稳定性，总体携带率均在80%以上。这3种毒力基因在食物中毒株中携带率也极高，均在96%以上，可以推断这3种毒力基因与菌株的侵袭力有关，与文献报道[7-8,10-12]一致。而本研究食物中毒株中sopE的携带率高达78.1%，符合报道[9]中该基因可增强沙门菌的致病性的特点。毒力基因spvR、pefA在食物中毒株中的携带率也较高，均在60%左右，符合其特点[14-16]，参与细菌在宿主内的粘附、存活和快速生长。而外膜蛋白shdA、菌毛基因agfA在非食品中毒株中的携带率高于中毒株，似乎与沙门菌侵袭力无关。

本研究中与细菌侵袭力关系最为密切的毒力基因为hilA、stn、invA、sopE，这4种毒力基因在各屠宰场沙门菌的携带率低，提示屠宰场沙门菌的侵袭力较低；而这些侵袭性基因在早市流动生禽摊点的高携带率，对人群健康存在严重的威胁，某些血清型存在暴发的风险，须加强对石家庄地区各早市流动生禽摊点储存和销售环节的食品卫生监督与防控。

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Salmonellavirulence gene analysis in poisoning food,slaughtering and commercial samples

NIU Li-ya1, XU Bao-hong2, CAI Wen-hua3, WANG Yan1,YANG Xin-ying1,GUO Yu-mei2, SUN Dian-xing1

(1.DepartmentofInfectiousandLiverdisease,BethuneInternationalPeaceHospital,Shijiazhuang050082,China;2.ShijiazhuangCenterforDiseaseControlandPrevention,Shijiazhuang050011,China;3.EmergencyCenter,HebeiAirportManagementGroupCo.,Ltd.,Shijiazhuang050802,China)

We investigated the carrying status of the virulence genes ofSalmonellafrom different sources in Shijiazhuang City, China, to provide the basic data for the further risk assessment ofSalmonella. A total of 186 isolates ofSalmonellafrom different sources were collected and identified serotypes in the area of Shijiazhuang from 2011 to 2016. PCR was performed for eight virulence genes (invA,sopE,agfA,spvR,hilA,stn,pefA,shdA). TheseSalmonellabacteria were detected in 13 kinds of serotypes.Enteritidisis a significant advantage of the group. The above 8 virulence genes were analyzed, and the virulence geneshilA,stnandinvAwere the most frequently carried, their respective carrying rate were 90.3% (168/186), 86.6% (161/186) and 82.8% (154/186) respectively. We found the virulence genes ofSalmonellafrom different sources were different. It is necessary to take measures to strengthen the food hygiene supervision and prevention and control of the storage and sale of raw poultry stalls in the morning market in Shijiazhuang area.

Salmonella; virulence genes; serotype; poultry food; risk assessment

Guo Yu-mei:Email:guokexin2199@163.com

郭玉梅，Email:guokexin2199@163.com

1.白求恩国际和平医院传染肝病科，石家庄 050082； 2.石家庄市疾病预防控制中心，石家庄 050011； 3.河北机场管理集团有限公司应急中心，石家庄 050802

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.012

R378.2

A

1002-2694(2017)07-0637-05

2017-02-20 编辑：张智芳

河北省卫生计生委2017年度医学科学研究重点课题(No.20170964)

Supported by key project of medical science research in 2017 by health and Family Planning Commission of Hebei(No.20170964)