输入性恶性疟原虫耐药相关基因Pfcrt和Pfmdr1单倍型及突变分析

徐 超，魏庆宽，李 瑾，肖 婷，尹 昆，孔祥礼，王用斌，崔 勇，孙 慧，赵桂华，朱 嵩，闫 歌，黄炳成

输入性恶性疟原虫耐药相关基因Pfcrt和Pfmdr1单倍型及突变分析

徐 超，魏庆宽，李 瑾，肖 婷，尹 昆，孔祥礼，王用斌，崔 勇，孙 慧，赵桂华，朱 嵩，闫 歌，黄炳成

目的 了解目前山东省输入性恶性疟原虫抗药性基因Pfcrt和Pfmdr1的单倍型，分析突变基因型及其分布情况。方法根据恶性疟原虫Pfcrt和Pfmdr1基因序列设计套式PCR引物，对采自全省非洲务工返乡的输入性恶性疟感染者血样扩增，并对其产物进行基因测序和序列对比分析。结果68例样本Pfcrt基因第72～76位点和Pfmdr1基因第86、1 042和1 246位点目的片段全部成功扩增和测序。Pfcrt基因中69.12%为野生单倍型CVMNK，30.88%为突变单倍型，突变型包括CVIET、CVIDT及混合型，其中CVIET数量最多。Pfmdr1基因中69.12%为野生单倍型NND，30.88%为突变单倍型，即YND及混合基因型。6个非洲输入来源国样本中，除几内亚Pfcrt基因全部为野生型外，其它国家Pfcrt和Pfmdr1基因均有突变型存在。5例样本Pfcrt和Pfmdr1基因共同表现为突变单倍型。结论山东省输入性恶性疟Pfcrt和Pfmdr1基因突变单倍型具有多样化特征。Pfcrt和Pfmdr1突变型比例均低于野生型，提示目前该省流行的输入性恶性疟未出现严重的氯喹耐药性。

恶性疟原虫；输入性病例；耐药性；Pfcrt基因；Pfmdr1基因；单倍型；突变型

恶性疟原虫耐药性已经成为全球有效控制和消除疟疾的主要障碍。长期使用单一抗疟药治疗疟疾会导致虫体产生抗性并将抗性传播至其它疟区种群[1]。上世纪50～60年代，氯喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶等传统抗疟药因具有疗效好、价格便宜等优点先后被作为一线药物广泛使用。然而，这些抗疟药在东南亚地区开始出现耐药型虫种，随后在全球范围内广泛传播，导致许多国家放弃使用[2]。目前多国采用以青蒿素为基础的联合用药(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)方案替代传统药物进行恶性疟治疗并取得了显著疗效。ACTs是目前治疗恶性疟感染最重要也是唯一没有形成普遍耐药的抗疟药物。然而，最近在东南亚大湄公河次区域已经发现对青蒿素耐药虫种，有可能面临ACTs抗性株传播风险[3]。因此，有必要监测和评估当前恶性疟对传统抗疟药的耐药趋势，预测传统药能再次被使用的可行性，有利于避免过度利用青蒿素造成的抗性传播。

疟原虫的某些基因可以作为分子标记用来研究其抗药性，监测这些分子标记的等位基因和单倍型能对药物敏感性进行有效预测，从而有助于指导疟疾临床用药[4]。恶性疟原虫第7号染色体的氯喹抗性转运蛋白基因(P.falciparumchloroquine resistance transporter，Pfcrt)全长大约3.1 kb，编码位于虫体食物泡内的PfCRT蛋白。大量研究证实Pfcrt基因多态性在虫体对氯喹耐药过程中起重要作用，尤其第72～76位点单倍型是研究焦点[5]。恶性疟原虫第5号染色体的多药耐药基因1(P.falciparummultidrug resistance-1，Pfmdr1)全长约4.3 kb，编码位于虫体食物泡膜上的P-糖蛋白同系物1(P-glycoprotein homologue 1，Pgh-1)。Pfmdr1基因多态性与恶性疟对氯喹、甲氟喹、喹啉、本芴醇等多种药物耐受性相关，其中第86、1 042、1 246位点氨基酸发生替换起到关键作用[6]。

山东省曾是疟疾的重要流行区，经几十年积极有效的综合防治措施，本地感染病例已降至较低水平。然而随着出国务工人员数量和流动性增加，该省输入性疟疾病例却在逐年递增，尤其是恶性疟患者。本文首次对山东省境外输入性恶性疟Pfcrt和Pfmdr1基因单倍型进行分析，旨在从分子水平上了解该省输入性恶性疟对氯喹等传统抗疟药的耐药情况，为临床合理用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 核酸抽提试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)购自德国Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、dNTP和PCR buffer购自大连宝生物公司。琼脂糖购自西班牙Biowest公司；电泳DNA marker和核酸染料GoldView购自北京索莱宝公司；引物由北京华大基因科技公司合成。Veriti 96-well Thermal Cycler循环扩增仪为美国Applied Biosystems产品；DYCP-31DN型核酸电泳仪为北京六一仪器厂产品；Chemidoc XRS凝胶成像系统为美国Bio-rad公司产品。

1.2 样本的采集 采集2011至2013年间从非洲尼日利亚等6国打工返回山东省人员中被地市CDC诊断为疟疾感染的上报病例血样共68份。经山东省疟疾诊断参比实验室镜检复核和PCR检测，全部病例样本确诊为单一恶性疟感染。阴性对照样本采集自本单位职工健康查体血样。血样的采集和病例信息调查经过病人知情同意。采集的抗凝血用1.5 mL EP管分装并编号，置于-80 ℃低温保存。

1.3 DNA的抽提 取每份标本0.2 mL抗凝血，按照核酸抽提试剂盒说明流程提取基因组DNA，提取后的DNA放置-20 ℃保存备用。

1.4 巢式PCR扩增和测序 参考文献报道，设计扩增包含恶性疟Pfcrt基因72～76位点和Pfmdr1基因第86、1 042、1 246位点片段的引物[7]。Pfcrt基因72～76位点外侧引物P1：5′-CCGTTAATAATAAATACACGCAG-3′，P2：5′-CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC-3′；内侧引物N1： 5′-TGTGCTCATGTGTTTAAACTT-3′，N2：5′-CAAAACTATAGTTACCAATTTTG-3′；产物片段长度145 bp。Pfmdr1基因第86位外侧引物P3：5′-TTAAATGTTTACCTGCACAACATAGAAAATT-3′，P4： 5′-CTCCACAATAACTTGCAACAGTTCTTA-3′；内侧引物N3：5′-TGTATGTGCTGTATTATCAGGA-3′，N4： 5′-CTCTTCTATAATGGACATGGTA-3′；产物片段长度526 bp。Pfmdr1基因第1 042、1 246位外侧引物P5：5′-AATTTGATAGAAAAAGCTATTGATTATAA-3′，P6：5′-TATTTGGTAATGATTCGATAAATTCATC-3′；内侧引物N5：5′-GAATTATTGTAAATGCAGCTTTA-3′，N6：5′-GCAGCAAACTTACTAACACG-3′；产物片段长度799 bp。第一轮25 μL PCR反应体系为：2.5 μL含Mg2+的10×PCR buffer，2 μL dNTP Mix(各2.5 mmol/L)，0.15 μLTaq酶(5 U/μL)，各1 μL正、反向外侧引物(10 μmol/L)，2 μL DNA模板，用ddH2O补足剩余体系。第二轮50 μL PCR反应体系为：5 μL含Mg2+的10×PCR buffer，4 μL dNTP Mix(各2.5 mmol/L)，0.25 μL Taq酶(5 U/μL)，各2 μL正、反向内侧引物(10 μmol/L)，3 μL第一轮产物模板，用ddH2O补足剩余体系。Pfcrt基因扩增反应条件：第一轮95 ℃预变性5 min，92 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，共30个循环，60 ℃总延伸3 min；第二轮95 ℃预变性5 min，92 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，共30个循环，65 ℃总延伸3 min。Pfmdr1基因扩增反应条件：第一轮95 ℃预变性3 min，93 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃总延伸5 min；第二轮反应条件与第一轮相同。反应完毕后，取5 μL第二轮产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪中观察结果并拍照保存。第二轮PCR产物送往北京华大基因科技公司进行测序。1.5 序列比对分析 从疟疾基因数据库(http://plasmodb.org/plasmo/)中下载恶性疟原虫Pfcrt基因(PF3D7_0709000)和Pfmdr1基因(PF3D7_0523000)参考序列。用MEGA 6.0软件分析比对样本序列和参考序列，筛查碱基位点突变情况。利用Chromas 2.0软件分析纯合突变型和混合基因型。

2 结 果

2.1 基本信息 68例输入性恶性疟感染病例的疟疾来源国包括尼日利亚21例、加纳16例、苏丹9例、刚果8例、莫桑比克7例、几内亚7例。所有病例中，男性67例，女性1例；年龄范围19～57岁，主要集中于25～50岁(83.82%)；主要职业为民工、海员、服务业人员等。

2.2 巢式PCR和测序结果 经套式PCR检测，68例输入性恶性疟样本Pfcrt和Pfmdr1基因目的片段全部扩增成功。Pfcrt基因第72～76位点目的片段在145 bp处出现单一条带(图1)；Pfmdr1基因第86位点目的片段在526 bp处出现单一条带(图2)；Pfmdr1基因第1 042、1 246位点目的片段在799 bp处出现单一条带(图3)；3个片段均与预期长度相符。MEGA 6.0软件分析结果显示所有样本PCR产物与参考序列同源性均达到97%以上，证明PCR结果完全正确。

2.3Pfcrt基因第72～76位点单倍型 68例恶性疟标本中，47例Pfcrt基因第72～76位氨基酸为野生型，即C72V73M74N75K76(CVMNK)单倍型，占69.12%(图4i)；21例为突变型，占30.88%。在所有的突变基因型种，第72和73位点均未发生突变，第74～76位点同时发生突变，具体为第74位点碱基ATG突变为ATT(氨基酸M74I)，第75位点碱基AAT突变为GAA或GAT(氨基酸N75E/D)，第76位点AAA突变为ACA(氨基酸K76T)。突变单倍型包括CVIET型15例，占71.43%(图4ii)；CVMNK和CVIDT混合型3例，占14.29%(图4iii)；CVMNK、CVIET、CVIDT混合型3例，占14.29%(图4iv)。对输入性恶性疟6个来源国家分析结果表明：尼日利亚有突变型9例，包括7例CVIET型，1例CVMNK和CVIDT混合型，1例CVMNK、CVIET、CVIDT混合型；加纳有突变型1例，为CVMNK和CVIDT混合型；莫桑比克有突变型1例，为CVMNK、CVIET、CVIDT混合型；苏丹有突变型5例，包括4例CVIET型，1例CVMNK和CVIDT混合型；刚果有突变型5例，包括4例CVIET型，1例CVMNK、CVIET、CVIDT混合型；几内亚全部为CVMNK野生型。

M：DNA标志物；A1～A8：恶性疟样本；A9：阴性对照；A10：空白对照M: DNA marker；A1～A8: P. falciparum samples; A9: Negative control; A10: Blank control.图1 pfcrt基因第72～76位点片段的套式PCR扩增结果Fig.1 Nested PCR amplification of codon 72 to 76 in pfcrt gene

M：DNA标志物；B1～B8：恶性疟样本；B9：阴性对照；B10：空白对照M: DNA marker; B1～B8: P. falciparum samples; B9: Negative control; B10: Blank control.图2 pfmdr1基因第86位点片段的套式PCR扩增结果Fig.2 Nested PCR amplification of codon 86 in pfmdr1 gene

M：DNA标志物；C1，C3～C6：恶性疟样本；C2：阴性对照；C7：空白对照M: DNA marker; C1, C3～C6: P. falciparum samples; C2: Negative control; C7: Blank control.图3 pfmdr1基因第1 042、1 246位点片段的套式PCR扩增结果Fig.3 Nested PCR amplification of codon 1 042 and 1 246 in pfmdr1 gene

codon 72～ codon 76：第72～76位点密码子 ⅰ：CVMNK单倍型(野生型) ⅱ：CVIET单倍型 ⅲ：CVMNK和CVIDT混合型 ⅳ：CVMNK、CVIET、CVIDT混合型(黑色箭头处为杂合位点)ⅰ: CVMNK haplotype (wild type); ⅱ: CVIET haplotype; ⅲ: CVMNK and CVIDT mixed haplotype; ⅳ: CVMNK, CVIET and CVIDT mixed haplotype. The black arrows indicate heterozygous loci图4 恶性疟样本pfcrt基因第72～76位点单倍型Fig.4 Codon 72 to 76 haplotypes in pfcrt gene of P. falciparum samples

2.4Pfmdr1基因第86、1 042和1 246位点单倍型 68例样本Pfmdr1基因第86位点氨基酸中，47例为野生型N，占69.12%；21例为突变型，碱基AAT突变为TAT(氨基酸N86Y)，占30.88%。在突变型中，14例为纯合突变(氨基酸Y)，7例为混合基因型(氨基酸N/Y)。所有样本Pfmdr1基因第1 042和1 246位点氨基酸均分别呈现野生型N和D。在86、1 042、1 246三个位点单倍型中，NND占69.12%(图5i)，YND占20.59%(图5ii)，NND和YND混合型占10.29%(图5iii)。对输入性恶性疟6个非洲来源国的突变型分析结果表明：尼日利亚有突变型4例，包括3例YND型，1例NND和YND混合型；加纳有突变型5例，包括1例YND型，4例NND和YND混合型；莫桑比克有突变型2例，包括1例YND型，1例NND和YND混合型；苏丹有突变型5例，包括4例YND型，1例NND和YND混合型；刚果有突变型2例，均为YND型；几内亚有突变型3例，均为YND型。

第86、1 042和1 246位点密码子 i：NND单倍型(野生型) ii：YND单倍型 iii：NND和YND混合型(黑色箭头处为杂合位点)codon 86、codon 1 042、codon 1 246：i: NND haplotype (wild type); ii: YND haplotype；iii: NND and YND mixed haplotype.The black arrows indicate heterozygous loci.图5 恶性疟样本Pfmdr1基因第86、1 042、1 246位点单倍型Fig.5 Codon 86, 1 042 and 1 246 haplotypes in Pfmdr1 gene of P. falciparum samples

2.5Pfcrt和Pfmdr1突变相关性 31例样本Pfcrt和Pfmdr1基因单倍型共同表现为野生型，即CVMNK + NND。5例样本Pfcrt和Pfmdr1基因单倍型共同表现为突变型，其中3例为CVIET+ YND纯合型，1例为CVIET+YND/NND混合型，1例为CVMNK/CVIET/CVIDT+YND混合型。16例样本表现为Pfcrt突变型和Pfmdr1野生型，包括11例为CVIET+ NND纯合型，3例为CVMNK/CVIDT+ NND混合型，2例为CVMNK/CVIET/CVIDT+ NND混合型。16例样本表现为Pfmdr1突变型和Pfcrt野生型，包括10例为CVMNK+YND纯合型，6例为CVMNK+YND/NND混合型。

3 讨 论

近年来，中国与国际间贸易、劳务输出等日趋频繁，境外输入性疟疾明显增多[8]。2011-2013年，山东省共报告疟疾病例340例，境外输入性病例占94.41%。其中，2013年由非洲输入的恶性疟病例在当年疫情中所占比例高达84.73%[9]。由于耐药型恶性疟在全球广泛分布，对人类健康造成严重危害，因此对输入性恶性疟实施耐药性分子监测具有重要意义。

恶性疟原虫pfcrt基因第72～76位突变与其耐药性紧密相关，其中K76T被认为是最关键的突变位点[10]。研究表明，pfcrt基因第72～76位单倍型主要存在2种突变型，即起源于泰国-柬埔寨边境地区的CVIET型和起源于哥伦比亚-委内瑞拉边境地区的SVMNT型[11]。在东南亚地区，泰国主要存在CVIET型；老挝同时存在CVIET和SVMNT 2种突变型；在柬埔寨还发现3种CVIET的衍生型，即CVIDT、CVTNT和CVMNT[12-14]。由于非洲恶性疟种群曾对氯喹普遍耐药，绝大多数非洲国家普遍存在CVIET型，而且是部分地区唯一高频突变的单倍型。此外，坦桑尼亚和安哥拉存在一定频率的SVMNT型；刚果和莫桑比克存在CVIDT和SVIET型；中非共和国存在少数的CVINT、CVIEK、SVIEK突变型等[15-17]。张国庆等[18]研究显示，在我国疟疾流行较为严重的云南和海南省，恶性疟种群pfcrt基因突变率超过70%。云南主要突变型为CVIET，同时还存在SVMNT和CVIKT型；海南仅发现CVIET型。本文中山东省输入性恶性疟Pfcrt基因第72～76位突变型所占比例为30.88%，明显低于云南和海南省本地恶性疟种群。另外，CVIET型(含混合型)在所有突变型中的比例高达85%以上，并且在尼日利亚、苏丹、刚果样本中均占据主导地位，与前期研究报道结论相符。本文还发现了一定比例的CVIDT型，在前期报道的云南本地恶性疟中未发现该突变型。值得注意的是，除几内亚外，其余5个非洲来源国均发现包含CVIDT的混合基因型，在一定程度上反应出CVIDT散播和分布的广泛性。

恶性疟原虫pfmdr1基因N86Y突变与其对氯喹耐药有重要相关性，被认为是仅次于Pfcrt基因K76T的重要抗性突变位点[19]。另外，有报道称恶性疟pfmdr1基因N1042D和D1246Y突变能降低虫体对氯喹耐药性程度[20]。不同地理位置恶性疟种群pfmdr1多态性分布有一定差别，比如N86Y主要广泛分布于亚洲和非洲；N1042D和D1246Y在南美洲出现频率较高。国内相关研究表明，尽管我国云南本地恶性疟种群K76T突变率非常高，但N86Y、N1042D和D1246Y的突变率相对较低[21-22]。本文中由非洲输入的恶性疟pfmdr1基因N86Y突变型(30.88%)低于野生型，与pfcrt突变型数量少于野生型情况一致，提示近期山东省输入性恶性疟氯喹抗性基因尚未出现高频突变情况。尼日利亚等6个来源国样本均存在N86Y突变型，暗示N86Y在非洲国家可能广泛分布。另外，本文未发现N1042D和D1246Y突变，这进一步证明非洲恶性疟种群发生这两种突变的概率较低。前期有研究指出，恶性疟pfcrt和pfmdr1基因之间具有连锁不平衡特征，2个基因发生联合作用可能造成更严重耐药性[23]。本文中有5例样本pfcrt和pfmdr1基因同为突变型，表明2个基因有联合突变的特性，但数量少于单一基因的突变型。

在氯喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶等传统抗疟药相继出现广泛耐药性后，WHO于2006年推荐引入ACTs作为治疗恶性疟的一线药物[24]。尽管ACTs有效遏制了全球疟疾疫情的严峻形势，但近期出现的青蒿素耐药型虫种对ACTs成功应用造成潜在威胁[25]。为此，评估重新使用氯喹等传统抗疟药的可行性，既有利于降低用药成本，更有助于避免出现因过度使用ACTs导致其耐药性广泛散播的危险局面。有研究表明，长期停止使用氯喹治疗后，恶性疟对药物敏感性会增强。非洲马拉维停止应用氯喹10年后，在8年时间里本地恶性疟pfcrt基因K76T突变型比例从85%下降至13%[26]。本文实验结果表明，山东省自非洲输入恶性疟pfcrt和pfmdr1突变型比例均少于野生型，在一定程度上提示了近期该省输入性恶性疟未出现严重的氯喹耐药，并存在对药物敏感性增强的可能。通过未来持续的抗性分子监测，为评估重新使用氯喹等传统抗疟药的可行性提供实验依据，有利于指导临床合理用药。

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Haplotype and mutation analysis of drug resistancePfcrtandPfmdr1 gene of importedPlasmodiumfalciparum

XU Chao, WEI Qing-kuan, LI Jin, XIAO Ting, YIN Kun, KONG Xiang-li, WANG Yong-bin,CUI Yong, SUN Hui, ZHAO Gui-hua, ZHU Song, YAN Ge, HUANG Bing-cheng

(ShandongAcademyofMedicalSciences,ShandongInstituteofParasiticDiseases,ShandongProvincialReferenceLaboratoryforMalariaDiagnosis,Jining272033,China)

In order to understand the drug resistancePfcrtandPfmdr1 gene haplotypes ofPlasmodiumfalciparumimportedcurrentlyin Shandong Province, we analyzed the mutant genotypes and their distribution situation. The blood samples were collected from malaria cases infected withP.falciparumderiving from Africa during 2011 to 2013 in Shandong Province.P.falciparumgenomic DNA was extracted and primers were designed according to thePfcrtandPfmdr1 gene sequences. Nested PCR amplification and sequencing were performed, and sequence alignment was carried out by using bioinformatics software. The results showed that all of 68P.falciparumsamples imported were amplified and sequencing successfully at codon 72-76 inPfcrtgene and codon 86, 1 042 and 1 246 inPfmdr1 gene. And 69.12% of the samples were wild type CVMNK inPfcrtgene and 30.88% were mutation types, including CVIET, CVIDTand mixed types, of which the CVIEThaplotype was the most. The 69.12% of the samples were wild type NND inPfmdr1 gene and 30.88% were mutation types including YND and mixed types. Among the six African source countries' samples, mutant gene types existed in all samples in bothPfcrtandPfmdr1 gene exceptPfcrtgenotype from Guinea were all wild type. Five samples had mutation types in bothpfcrtandpfmdr1 gene together. What could be drawn conclusion from the results was that mutantPfcrtandPfmdr1 haplotypes expressed diversification in the importedP.falciparumcases in Shandong Province, and the proportion of mutant genotypes were less than wild genotypes, which suggested that it was not appeared serious chloroquine-resistant of the importedP.falciparumprevalence in Shandong Province currently.

Plasmodiumfalciparum; imported malaria cases; drug resistance;Pfcrtgene;Pfmdr1 gene; haplotype; mutant genotypes

Huang Bing-cheng, Email: hbc863@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.003

黄炳成，Email: hbc863@hotmail.com

山东省医学科学院，山东省寄生虫病防治研究所，山东省疟疾诊断参比实验室，济宁 272033

R382.31

A

1002-2694(2016)12-1051-07

2016-05-25；

2016-09-28

山东省医药卫生科技发展计划项目(No.2016WS0394)，山东省自然科学基金(No. ZR2014YL036，2012ZRC03040)，山东省医学科学院医药卫生科技创新工程，全球基金中国疟疾项目(No. 201201055)，山东省医学科学院课题计划(No. 2014-59)联合资助

Supported by the Projects of Medical and Health Technology Development Program in Shandong Province(2016WS0394)，Natural Science Fund of Shandong Province (Nos. ZR2014YL036, 2012ZRC03040),The Innovation Project of Shandong Academy of Medical Sciences,China Malaria Project of the Global Fund to Fight AIDS, Tuberculosis, and Malaria (No. 201201055), and the Project of Shandong Academy of Medical Sciences (No.2014-59)