单增李斯特菌三重实时荧光PCR检测的建立及其毒力基因在分离菌株中分布

刘二龙，袁慕云，吕英姿，陈　颖，王　娉，许龙岩，李嘉琪，郑高彬，杜雅萍，林学勤



单增李斯特菌三重实时荧光PCR检测的建立及其毒力基因在分离菌株中分布

刘二龙1，袁慕云2，吕英姿1，陈颖3，王娉3，许龙岩2，李嘉琪1，郑高彬1，杜雅萍1，林学勤1

1.黄埔出入境检验检疫局，广州510730；2. 广东出入境检验检疫局，广州510623；3.中国检验检疫科学研究院，北京100025

摘要:目的建立同时检测单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)溶血素基因hlyA、内化素基因inlA和磷脂酶C基因plcB的TaqMan-MGB三重实时荧光PCR检测方法，并对101株单增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB基因进行了检测，分析3个毒力基因在多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)聚类群组中的分布情况。方法根据单增李斯特菌毒力基因hlyA、inlA和plcB的保守序列设计引物和小沟结合物(minor groove binder,MGB)探针建立三重荧光PCR方法，对其特异性、灵敏度和可重复性进行了测试，并对分离的101株单增李斯特菌进行三重PCR检测。结果建立的三重实时荧光PCR方法特异于单增李斯特菌的检测，重复性良好，组内Ct值变异系数均小于1.5%,灵敏度可达100 CFU/mL。对101株单增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB的检出率分别为98%、75%和98%。在可被MLST分型的89株菌株中，groupI的30株菌株有20株均缺失inlA基因；groupII的57株菌株中有56株三个基因均检出;groupIII的菌株hlyA、inlA和plcB三个基因均未检出。结论本文建立的三重实时荧光PCR方法能准确、快速、稳定的检测单增李斯特菌，101株单增李斯特菌的hlyA、inlA、plcB三个毒力基因的检出情况与单增李斯特菌的MLST分型聚类有较一致的关系，对分析单增李斯特菌毒力的强弱有重要参考意义。

关键词:单增李斯特菌；TaqMan-MGB三重实时荧光PCR;毒力基因分布; 多位点序列分型

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一种革兰氏阳性胞内寄生菌，主要引起成人败血症和新生儿脑膜炎等疾病，报道显示，美国每年大约有2 500例单增李斯特菌病患者，占总住院人数的4%,但死亡人数占食源性致病病例的28%[1-3]。

传统的单增李斯特菌分离鉴定方法无法满足单增李斯特菌高通量快速检测的需求。本文根据单增李斯特菌的溶血素基因hlyA、内化素基因inlA和脂酶基因plcB的保守序列设计特异性引物探针，建立了基于小沟结合物(minor groove binder,MGB)探针的三重实时荧光PCR方法，探针的5′端采用不同的荧光报告基团(FAM、VIC和NED)标记，3′端增加的MGB基团，使探针结合靶序列的严谨度和检测的分辨率均得到提高[4]。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源本研究共选用单增李斯特菌菌株101株，其中100株菌株为广东出入境检验检疫局技术中心和中国检验检疫科学研究院分离保存，所有菌株重新经API listeria确认为单增李斯特菌。另1株为单增李斯特菌标准菌株(ATCC19115)。其他供试菌株为：英诺克李斯特菌(ATCC 33090)、伊氏李斯特菌(ATCC19119)、表皮葡萄球菌(CMCC 26069)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、鼠伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50115)、非01霍乱弧菌(Vb0)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、弗氏柠檬酸杆菌(ATCC43864)均购自陆桥生物技术公司。

1.1.2主要试剂Premix Ex TaqTM(TaKaRa)DNA marker(TaKaRa)。(大连宝生物工程有限公司)，脑心浸液肉汤(Brain Heart Infusion broth, BHI)(北京陆桥技术股份有限公司),碱性蛋白胨水(北京陆桥技术股份有限公司)。

1.1.3主要仪器ABI7500荧光PCR仪(ABI)；12GC全自动核酸纯化系统(precision system science)；CT15RE高速冷冻离心机(HITACHI)；ND2000C微量分光光度计(Thermo Scientific)；生化培养箱(德国Binder)。

1.2方法

1.2.1菌株模板制备取37 ℃过夜培养菌液1 mL置2 mL离心管离心去培养基后，用1 mL去离子水漂洗，12 000 r/min离心2 min去上清，重复2次。最后加200 μL去离子水在核酸提取仪上提取DNA备用。

1.2.2引物和探针设计根据GenBank公布的单增李斯特菌hlyA，inlA,plcB基因的保守序列，采用ABI primer express 3.0软件设计引物及MGB探针，具体序列见表1，委托英潍捷基公司合成。使用前将引物和探针稀释成20 μmol/L,-20 ℃保存备用。

1.2.3三重实时荧光PCR方法的建立及优化以单增李斯特菌标准菌株ATCC19115为阳性模板，优化后反应体系(30 μL)如下：Premix Ex TaqTM(2×)15 μL、hlyA、inlA、plcB引物探针(20 μmol/L)分别为0.5 μL、ROX0.3 μL、去离子水8.2 μL、DNA模板为2 μL。反应条件：Stage 1：预变性95 ℃ 30 s；Stage 2：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环，并于FAM、VIC，NED 3个通道收集荧光信号；扩增反应在ABI7500荧光定量PCR仪上进行。结果判断：待测基因出现扩增曲线，且Ct值<36,则判断为阳性；如果36

表1单增李斯特菌毒力因子hlyA、inlA、plcB引物和探针序列Tab.1Primers and probe sequences of virulence factors for Listeria monocytogenes

引物名称引物序列(5'→3')扩增长度bphlyA-FCCTCGGAGACT-TACGAGATATTTTG72hlyA-RGCAATGGGAACTCCTGGTGTThlyA-PFAM-AAGGTGCTACTTTTA-ACC-MGBinlA-FTAACAGACACGGTCTCGCAAA66inlA-RTCCCTAATCTATCCGCCTGAAGinlA-PVIC-AGATCTAGACCAAGTTA-CAAC-MGBplcB-ACCAGCAGCTCCGCATGA69plcB-RTCCGCGGACCAACTAAGTTTAplcB-PNED-ATCGACAGCAAATTA-MGB

1.2.4三重实时荧光PCR的特异性试验按1.2.1提取单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、伊氏李斯特菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、非01霍乱弧菌、副溶血性弧菌、弗氏柠檬酸杆菌基因组DNA，用1.2.3建立的三重实时荧光PCR体系进行特异性试验。

1.2.5三重实时荧光PCR的灵敏度试验及标准曲线制作将初始浓度为3×108CFU/mL的单增李斯特菌标准菌株培养液稀释成1×108CFU/mL，然后进行10倍梯度稀释成1×107CFU/mL～1×101CFU/mL，每个稀释度取1 mL按1.2.1提取DNA，按1.2.3建立的三重实时荧光PCR体系进行扩增，并绘制标准曲线。

1.2.6三重实时荧光PCR可重复性试验选取10倍倍比稀释1×107CFU/mL～1×101CFU/mL的单增李斯特菌菌液1 mL按1.2.1提取基因组DNA对本文建立的三重荧光PCR方法的可重复性进行测试，每个稀释度3个重复，通过对各次试验结果所得Ct值的变异系数进行分析来评价三重实时荧光PCR反应体系的稳定性。

1.2.7单增李斯特菌分离株毒力基因三重实时荧光PCR检测及毒力基因分布对101株单增李斯特菌采用本文建立的三重实时荧光PCR方法进行毒力基因的检测。并结合本课题组单增李斯特菌分离株MLST分类的结果(另文发表)，分析毒力基因在MLST聚类分群中的分布情况。

2结果

2.1三重实时荧光PCR的特异性试验结果按1.2.4进行三重实时荧光PCR特异性试验结果显示，单增李斯特菌标准菌株可以同时检测到hlyA、inlA和plcB3个基因，其它菌株3个基因均无明显扩增曲线。表明本方法与其他阴性菌无交叉反应, 本文所建立的探针实时荧光PCR检测方法特异性良好，见图1。

2.2三重实时荧光PCR的灵敏度试验及标准曲线制作按1.2.5的灵敏度测试结果显示，hlyA、inlA和plcB基因三重实时荧光检测体系的最低检测浓度达1×102CFU/mL，见图2。采用1×107CFU/mL～1×102CFU/mL 6个稀释度分别绘制hlyA、inlA和plcB标准曲线，标准曲线的相关系数R2分别为0.99、0.98和0.99，扩增效率分别为106%、112%和110%，见图3，表明检测体系的3个基因扩增效率和线性相关系数良好，可以满足三重实时荧光PCR检测的要求。

1：单增李斯特菌；2-9：英诺克李斯特菌、伊氏李斯特菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、非01霍乱弧菌、副溶血性弧菌、弗氏柠檬酸杆菌1：Listeria monocytogenes；2-9：Listeria innocua,Listeria ivanovii,Staphylococcus epidermidis,Staphyl-ococcus aureus,salmonella typhimurium,Vibrio cholerae,Vibrio Parahemolyticus,Citrobacter freundii图1　单增李斯特菌的多重实时荧光PCR的特异性测试Fig.1　Specificity test of multiplex real-time PCR for Listeria monocytogenes

1-7分别为：1×107CFU/mL,1×106 CFU/mL，1×105 CFU/mL，1×104 CFU/mL，1×103 CFU/mL，1×102 CFU/mL，1×101 CFU/mL图2　多重实时荧光PCR灵敏度测试Fig.2　Sensitivity test of multiplex real-time PCR for Listeria monocytogenes

图中示标准曲线方程，相关系数R2值和扩增效率E值。Standard curves，the correlation coefficient(R2)values and the amplification efficiency(E) values were shown in the figure.图3　单增李斯特菌三重实时荧光PCR标准曲线 Fig.3　Standard curves of triplex real-time PCR assay for detection of Listeria monocytogenes

2.3三重实时荧光PCR可重复性试验选取1×107CFU/mL～1×102CFU/mL的单增李斯特菌菌液提取模板进行三重实时荧光PCR检测，每个稀释度做3个平行，结果表明3种毒力基因的Ct值变异系数均在2%以下见表2，说明本文建立的三重实时荧光PCR检测方法重复性好，稳定可靠。

表2三重实时荧光PCR检测单增李斯特菌的可重复性测试Table 2Reproducibility of multiplex real-time PCR for Listeria monocytogenes

菌液浓度(CFU/mL)重复3次Ct值平均Ct值CV(%)123hlyAInlAplcBhlyAInlAplcBhlyAInlAplcBhlyAInlAplcBhlyAInlAplcB1×10721.1021.0421.2521.3821.4121.4321.3221.5621.4221.2721.3421.370.691.250.471×10624.1924.5624.6224.7724.9824.8024.7025.1324.7824.5521.3421.371.291.190.401×10528.0128.6728.1528.2028.9228.2128.2528.9628.2428.1524.8924.730.450.540.161×10431.5032.4431.4132.0232.8831.631.9632.4931.7031.8328.8528.200.890.740.471×10335.3135.6435.0435.3936.0935.1235.4736.0235.0135.3932.6031.570.230.670.161×10238.4038.6138.5638.9139.3038.2938.5738.9337.8738.6338.9538.240.670.890.91

表3101株单增李斯特菌毒力基因三重实时荧光PCR毒力基因检测结果及分布Tab.3The distribution of 3 virulence gene in 101 Listeria monocytogenes strains

ST型Sequencetypes菌株数NumberofstrainshlyA基因阳性菌株数PositivenumberofhlyAinlA基因阳性菌株数PositivenumberofinlAplcB基因阳性菌株数PositivenumberofplcBSTsUPGMA聚类群组STsalignedbyUPGMA1,3,4,5,59,73,87,201,218,330,456,517,New1,New2,New8,New9,New11,New14,New16,New17,New22,New23,New2530301030groupI7,8,9,14,19,34,98,101,121,122,155,307,343,New3,New4,New5,New7,New10,New13,New15,New18,New19,New20,New21,New24,New2657575657groupIINew6,New122000groupIIIUnidentifiedsequenctypes12121012unknown

*new1-new26为新发现的STs，尚待提交MLST网站后分配相应的编号。

2.4单增李斯特菌毒力基因三重实时荧光PCR检测及毒力基因分布应用本文建立的三重实时荧光PCR方法对101株单增李斯特菌进行了检测，101株单增李斯特菌毒力基因分布情况及与MLST的聚类群的关系如表3所示。hlyA、inlA和plcB基因的检出率分别为98%、75%和98%。其中89株按MLST进行了分型，另12株因未获得MLST要求的7个管家基因序列的完整片段而无法进行MLST分型。

3讨论

单增李斯特菌被世界卫生组织列为重点监测的食源性病原菌之一[5]。中国目前虽然未曾暴发人感染单增李斯特菌病，但多位研究者从各地多种食品中均分离出单增李斯特菌[6-7]，其风险性不容忽视。

单增李斯特菌毒力基因主要集中在两个毒力岛LIPI-1和LIP-2(又称为内化素小岛)，其中hlyA、plcB属于LIP-1，inlA属于LIP-2[8-9]。hlyA基因是单增李斯特菌最重要的毒力基因，编码的李斯特菌溶血素O(listeriolysin，LLO)是单增李斯特菌最重要的一种毒力因子，为细菌入侵宿主细胞及帮助细菌逃脱吞噬泡所必需[10]。有研究显示，缺失hlyA序列的单增李斯特菌无法入侵宿主细胞，对宿主无毒性[11-12]。InlA基因编码内化素，它与细菌的侵袭相关，位于菌体表面, 与特异性受体钙黏蛋白(E-cadherin)结合,介导细菌侵袭入细胞并内化至吞噬小体,是建立感染的前提。有研究结果显示，InlA/InlB基因双缺失后，单增李斯特菌菌株的毒力明显减弱[13-15]。于丰宇等有关小鼠毒力实验的LD50也显示，内化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是导致菌株毒力降低的原因,目前有关报道表明致病性的LM都含有inlA,inlB[16-17]。plcB编码磷脂酰胆碱磷脂酶(PC-PLC)，是细菌在宿主细胞间扩散并突破双层膜时需要的关键因子之一，还可帮助单增李斯特菌逃离吞噬小体[18]。

本文101株单增李斯特菌菌株中hlyA基因、plcB基因检出率均为98%。提示其在单增李斯特菌中毒力基因中占重要位置(除groupIII的两株菌株未检出hlyA基因、plcB基因外，其他菌株均有检出)。inlA基因的共有25株菌株未检出，占整个101株单增李斯特菌菌株的24.8%，其中的20株属于groupI，占整个groupI中30株菌株的比例为67%(20/30)，提示groupI中缺失inlA基因的菌株比例较高。至于本文中单增李斯特菌菌株中inlA基因缺失株与inlA基因阳性菌株的毒力有无差异有待于进一步实验确认。

本课题组将101株单增李斯特菌菌株进行了MLST分型分析，发现可将其中的1-89号共89株单增李斯特菌根据MLST分型并获得相应的STs,并聚类分成3个群组：groupI,groupII和groupIII(分别与血清型谱系lineageI,lineageII和lineageIII相对应)。序号1-57共57株单增李斯特菌属于groupII(相应于血清型分类的lineageII，)，除了序号44的菌株inlA基因阴性外，其余56株单增李斯特菌的hlyA、inlA、plcB3个基因均为阳性；序号58-87共30株单增李斯特菌属于groupI(相应于血清型分类的lineageI，)，其hlyA、plcB均为阳性，但inlA基因阴性率较高(共20株，占67%)；序号88、89共2株单增李斯特菌属groupIII(相对应于血清型分类的lineageIII)，其3个毒力基因hlyA、inlA、plcB3个基因全部未检出。对于序号90-101这12株菌株，本课题组发现因未能获得MLST要求的7个管家基因的完整序列而能成功进行MLST分型，但采用本文建立的三重实时荧光PCR方法，除序号90号和序号101的菌株不能检出inlA基因外，其他均可检出hlyA、inlA、plcB3个毒力基因，且经API listeria确认为全部为单增李斯特菌，提示应进一步完善MLST的分型方法。

目前认为单增李斯特菌具有13个血清型，可分为4个谱系，lineageI、lineageI、lineageIII 和lineageIV[19]。90%以上的李斯特菌病病例均由1/2a、1/2b、4b型引起，其中大多数暴发病例归因于4b型。其中1/2b、4b属lineageI，1/2a属lineageII[20-23]。lineageIII和lineageIV谱系包含菌株数量很少，lineageIII血清型大多毒力较弱,很少引起发病[24]。在本次101株单增李斯特菌毒力基因的检测中，除未能MLST分型的12株菌株(序号90-101)外，89株单增李斯特菌中有87株菌株均分布于lineageII(groupII)和lineageI(groupI)这两个血清家系中，占比98%，且3个毒力基因均阳性的比例为75%,2个毒力基因均阳性的比例为98%，说明其毒力基因保持相对完整，具较强潜在致病力。其余2株(序号88-89)分布于groupIII (lineageIII)，结合其3个毒力基因均为阴性的结果表明，lineageIII中2株菌株的3个毒力基因均缺失，与lineageIII这一血清家系其毒力较弱的情况较为一致。此外从3个基因的检出率显示，groupII (lineageII)菌株阳性的毒力基因多于groupI (lineageI)的菌株,与其毒力强弱是否相关有待进一步的研究。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.007

通讯作者：许龙岩，Email: xlyciq@126.com

中图分类号：R378

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)05-451-06

Corresponding author:Xu Long-yan,Email:xlyciq@126.com

收稿日期：2015-12-29修回日期：2016-02-03

Development of triplex TaqMan MGB-probe real-time PCR assay for detection ofListeriamonocytogenesand the distribution of virulence gene in isolates

LIU Er-long1,YUAN Mu-yun2,LU Ying-zi1,CHEN Ying3,WANG Ping3,XU Long-Yan2,LI Jia-qi1,ZHENG Gao-bing1,DU Ya-ping1,LIN Xue-qin1

(1.HuangpuEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510730,China；2.GuangdongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510730,China；3.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100025,China)

Abstract:To develop a sensitive and specific triplex TaqMan-MGB real-time PCR assay for the detection of Listeria monocytogenes isolated from animal derived food，specific primers and MGB probes targeted toward the hylA,inlA and plcB gene were designed based on the conserved sequences.Then,the virulence genes distribution among groups(groupI,groupII,groupIII) which aligned by Multilocus sequence typing (MLST)was analyzed. The results showed that the assay developed in this study has good sensitivity,specificity and repeatability for the detection of Listeria monocytogenes.The detection limit was 100 CFU/mL in pure culture.and the amplifying efficiencies and the correlation coefficient of standard curves were all in the acceptable ange.The positive rates of hylA,inlA and plcB were 98% (99/101),75% (76/101) and 98% (99/101) respectively in 101 Listeria monocytogenes strains. Among 89 of 101 strains classed into 3 clusters(groupI,groupII and groupIII) by MLST，20 of 30 isolates belonged to groupI were all negative in inlA gene;56 of 57 isolates belonged to groupII were positive in all 3 virulence gene；2 isolates grouped into groupIII which hlyA,inlA and plcB were all negative.The detection result showed that the distrubution of 3 virulence gene consistented with the type groups clustered by MLST and provided remarkable references value for evaluating the virulence of Listeria monocytogenes.

Key words:Listeria monocytogenes;TaqMan-MGB real-time PCR; distribution of virulence genes; Multilocus sequence typing Supported by Science and Technology Planning Project of Guangdong Province,China (No.2013B040402004)

广东省科技计划项目(No.2013B040402004)资助