南京地区2011-2012年度门诊婴幼儿轮状病毒腹泻的分子流行病学研究

蒋翠莲，顾平清，叶莉莉，杨 艳，付建光

A组轮状病毒(Rotavirus, RV)是引起婴幼儿及多种动物急性重症腹泻的最主要病原，全球每年约有1.3亿婴幼儿感染RV，其中200万到400万病例住院，死亡病例更是高达60万，死亡病例大部分发生在发展中国家[1-3]。

RV属于呼肠孤病毒属，核心为双股RNA，由11个不连续的RNA片段组成，每个片段编码1个或2个结构蛋白(VP1～VP7)或非结构蛋白(NSP1～NSP6)[4]。其中VP4和VP7是病毒的表面中和抗原，根据VP4和VP7的抗原性差异可分为35个P基因型(相对应14个P血清型)和27个G基因型(15个G血清型)，其中几个基因型可同时感染人和动物[5-7]。

本文对2011年7月至2012年6月南京市妇幼保健院门诊腹泻婴幼儿的RV感染特征及基因分型进行了初步的研究。

1 材料与方法

1.1标本 对2011年7月-2012年6月间在南京市妇幼保健院门诊就诊的腹泻患儿(包括新生儿)粪便进行RV胶体金检测，试剂盒采用轮状病毒腺病毒抗原检测试剂盒(杭州，艾博生物医药有限公司)，阳性标本送至江苏省疾病预防控制中心进行分型检测，所有标本-70 ℃冰冻保存。

1.2标本处理 加入1 mL生理盐水至1.5 mLEP管中，加入0.1 g固体粪便标本或0.1 mL液体粪便标本，置于漩涡震荡器混匀，室温静置10 min，室温下≥5 000 r/min离心5 min，吸取上清液，置-20 ℃冰箱保存。

1.3核酸提取 利用ABI自动核酸提取仪提取，试剂采用ABI 5X MagMAXTM-96 Viral Isolation Kit(美国ABI公司)，提取方法按照试剂盒说明书。

1.4巢式逆转录聚合酶链反应(nRT-PCR)扩增片段 将RV阳性标本进行nRT-PCR扩增。试剂盒为Qiagen One Step RT-PCR Kit(德国QIAGEN公司)。反应采用国家CDC推荐的引物及反应条件[8-10]，反应结束后取4 μL扩增产物, 在2%的琼脂糖凝胶上以110V恒压状态电泳50 min, 通过GEL Doc 2000(Bio-Rad)凝胶成像系统观察RV特异性扩增条带。每批电泳用已测序证实为RV阳性的RT-PCR产物作为阳性对照。-20 ℃保存 PCR产物。

1.5序列测定和分析 将PCR阳性产物送公司进行纯化和测序。从GenBank的核酸序列数据库中下载多株国内外RV的核酸序列片段，将下载序列同我们检测到的本地区的RV序列用DNAStar公司的MegA5.1软件，采用CLUSTALW方法进行序列比对，利用neighbor-joining法构建进化树。

1.6统计方法 采用SPSS 13.0软件统计，计数资料比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1流行病学特征 我们对2011年7月-2012年6月间的2 081例腹泻患儿进行了RV胶体金检测，共发现阳性病例165例，阳性率为7.9%。全年均有RV感染发生，高峰季节为10月份至次年的2月份(图1)。94%的感染患儿都在2岁以下，其中1～3月龄感染患儿最多，13～24月龄为高发年龄段(图2)。

图12011-2012年南京地区RV腹泻儿童病例数的季节分布

Fig.1SeasonaldistributionofrotavirusdiarrheachildreninNanjingfrom2011to2012

图22011—2012年南京地区RV腹泻儿童病例数的年龄分布

Fig.2AgedistributionofrotavirusdiarrheachildreninNanjingfrom2009to2012

2.2G/P分型 将165例RV阳性标本进行G/P分型。如表1所示，G分型结果中G1, G3, G9为主要G分型，占G分型的78.2%，这其中G9所占比例最大，约为35.2%，G未分型(GNT)及G混合型(GMIX)也占有一定比重为15.8%。P分型中P[8]则是最常见的P分型，占P分型的64.2%，P[4]为16.4%，P未分型(PNT)及P混合型(PMIX)共占19.4%。常见的G/P组合为：G1P[8](16.4%)， G3P[8](13.9%)， G9P[8](24.8%)。

表12011年至2012年南京地区轮状病毒G/P分型

Tab.1RotavirusGandPgenotypesinNanjingfrom2011to2012

TypeP[4]P[8]PNTPMIXTotalG18272340G253--8G35231231G97413758GNT-48618GMIX262-10Total271041618165

2.3序列测定 通过对部分VP7及VP4基因第一轮扩增产物进行测序并与相应参考株进行对比，我们发现G1和G3毒株彼此间的同源性很高，分别为99.6%～100%及99.5%～100%，两者所有毒株各分属于一个亚型G1-Ic，G3-Ia，而G9毒株间的同源性为92.6%～100%，大部分毒株属于G9-IV亚型，同时也有一小部分归于G9-III亚型。P分型中，P[8]毒株间的同源性为87.2%～100%，主要为P[8]-II，少数为P[8]-IV。P[4]毒株间的同源性为97.5%～100%，与P[4]-Vc亚型参考株的同源性最高。

3 讨 论

在我国每年RV感染引起的婴幼儿腹泻约有1 200万例，造成了沉重的经济负担和社会负担[11]。考虑到尚无特效的抗病毒药物治疗，因此预防性接种RV疫苗成为了首选方法。在许多国家，RV的感染率和死亡率都随着疫苗的广泛接种而大幅下降[12]。目前我国接种比较广泛的是兰州生物制品生产的G10P[12]型LLR RV疫苗，接种后感染率也已经得到了降低[13]。但是随着时间推移，RV不断变异，流行毒株也在发生着变化，因此掌握更全面的毒株信息可以为将来研发更加有效的疫苗提供必要的科学依据。

在本研究中，我们发现RV感染是引起南京地区婴幼儿腹泻的重要原因。我们对2011年7月-2012年6月间共2 081例腹泻患儿进行了RV胶体金检测，阳性病例165例，阳性率为7.9%。这明显低于李梅等[14]及林谦等[15]报道的南京地区的阳性率，分析原因可能是我们样本来源的医院为妇幼保健院，病例以新生儿和3月龄以下的婴幼儿为主，而这部分群体的腹泻多为功能性腹泻，与病毒感染无关；此外，我们在进行初筛时所应用的检测试剂盒为杭州艾博生物的试剂盒，而未采用更加普及的万泰的试剂盒。两者之间的检测特异性和灵敏性未曾做过比较，也未见相关报道，考虑有可能是试剂盒灵敏度低导致总体阳性率偏低。RV腹泻又称为小儿秋冬季腹泻，图1表明全年均有RV感染发生，但高峰季节为10月份至次年的2月份，这与多数地区的报道一致[16-18]。对不同年龄组的RV腹泻患儿进行分析发现94%的感染患儿都在2岁以下，其中1～3月龄感染患儿最多，13～24月龄为高发年龄段，这可能与该年龄段患儿体内的母体抗体已经基本消失，而且学会走路接触的东西繁多喜欢吃手指等多种原因有关。

图3轮状病毒G分型VP7核苷酸序列进化分析

Fig.3PhylogenetictreesforthenucleotidesequencesoftheVP7regionofGgenotyping

图4轮状病毒P分型VP4核苷酸序列进化分析

Fig.4PhylogenetictreesforthenucleotidesequencesoftheVP4regionofPgenotyping

RV的遗传多样性与不同区域内新流行毒株的出现有关，常见的RV流行株包括G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]，G4P[8]和G9P[8][19]。国内的相关研究表明，我国最常见的流行株为G1P[8]和G3P[8]，同时也有其他毒株的报道(G1P[4]，G2P[4]，G3P[4]，G4P[8]和 G9P[8])[20-21]。此次研究发现南京地区G分型结果中G1, G3, G9为主要G分型，占G分型的78.2%，这其中G9所占比例最大，约为35.2%，G未分型(GNT)及G混合型(GMIX)也占有一定比重为15.8%。这与林谦等[15]的报道不同，G9型毒株开始占有最大比重，这提示G型流行毒株可能已经开始出现改变。1983年美国首次报道了G9型毒株，随后在许多国家都开始出现G9感染的报道，并逐渐成为重要的流行株[22-24]。在我国，1994年首次出现关于G9毒株的报道，随后常有散发报道[25-28]。章等[29]对1998年至2004年我国9个地区的G9型毒株进行监测分析发现，G9型检出率有逐渐升高趋势，总体检出率为3.5%，早期型别组合为G9P[6]，从2001年以后逐渐变为G9P[8]。在P分型的检测中P[8]则是最常见的P分型，占P分型的64.2%，P[4]为16.4%，P未分型(PNT)及P混合型(PMIX)共占19.4%。这同世界大多数地区的报道一致，未有明显改变。常见的G/P组合为：G1P[8](16.4%)， G3P[8](13.9%)， G9P[8](24.8%)。这同林等[15]报道的南京地区的G/P组合相似，但是G9P[8]取代了G3P[8]成为了优势型别组合。

目前国内对G/P分型的亚型报道较少，我们进一步测序进行亚型比对，以便得到更加全面的信息。同相关参考株比对后我们发现G1和G3毒株彼此间的同源性很高，两者所有毒株各分属于一个亚型G1-Ic，G3-Ia； G9型毒株间的同源性为92.6%～100%，大部分毒株属于G9-IV亚型，同时也有一小部分归于G9-III亚型。章青等[29]的研究中1998年至2004年我国检出的G9都属于G9-III亚型，而我们的研究发现G9-IV亚型占据了更大的比例，这种亚型的转变可能使得毒株的组织血型抗原(Histo-blood group antigens, HBGA)识别模序即中和抗原表位发生了变化，而这些抗原表位的改变也许同样驱动着HBGA亲和力的改变及人群易感性的改变[30]，因此最终导致G9型毒株超越了G1型毒株成为流行株。P分型中，P[8]毒株间的同源性为87.2%～100%，主要为P[8]-II，少数为P[8]-IV。这与国外报道常见的P[8]-III有所差异[31-32]，但是与武汉的报道相似[33]，说明我国P[8]毒株主要为P[8]-II 亚型。3个P[4]毒株间的同源性为97.5%～100%，与P[4]-Vc亚型参考株的同源性最高。

综上所述， RV感染是引起南京地区婴幼儿腹泻的重要病因，这其中G9P[8]是最主要的流行型别，同时G1P[8]和G3P[8]也占较大比例。亚型比对结果表明G9亚型已经出现了转变，由G9-III亚型转为G9-IV亚型为主，P[8]仍以P[8]-II 亚型为主。有鉴于此，进一步的加强监测，密切关注流行毒株的变化，同时得到完整的基因组信息也将是我们的下一步工作重点。

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