荧光偏振技术在布鲁氏菌病检测中的应用

訾占超，亢文华，马 英，赵柏林

布鲁氏菌病(简称为布病)是由布鲁氏菌引起的人兽共患病，多发于家畜中的牛、羊、猪，引起高热、流产等症状，阳性病畜暴露人群有高度的感染风险。世界动物卫生组织(OIE)曾将该病列为B类动物疫病，现在是必须报告的动物疫病，我国将该病列为二类动物疫病。中国政府制定的《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》(国办发〔2012〕31号)中将该病确定为优先防治的国内动物疫病，并制定了控制净化时间表。

近年来，布病感染病例呈回升态势，特别是在内蒙古地区，成为严重影响公共卫生和社会经济发展的问题，布病的防控形势依然严峻。对于布病的防控，早期检测是治疗和预防的关键环节。目前用于检测的技术有很多，细菌分离培养仍然是检测的金标准，但是该方法在临床上分离率较低，耗时长，且对分离环境和实验室工作人员存在感染的威胁。血清学检测多以光滑性脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)为检测抗原，包括试管凝集试验(serum tube agglutinationtest, SAT)，玫瑰红染色试验(rose Bengal test, RBT)，改进玫瑰红染色试验(modified Rose Bengal test,m-RBT)，虎红平板凝集试验(rose-Bengal plate agglutination test，RBPT)，缓冲平板凝集试验(rose-Bengalplateagglutination test, BPAT)，补体结合试验(complement fixation test, CFT)，酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)，间接免疫荧光抗体试验(indirect immuno- fluorescence assay, IFA)，胶体金免疫层析法(gold immumofiltraition assay, GICA)，全乳环状实验(milk ring test, MRT)，利凡诺 ( Rivanol) 试验，卡片抗原试验(Card Test, CT)，皮肤变态反应(Skin allergy)，微粒富集荧光免疫分析(particle concentration fluorescence immunoassay, PCFIA)，快速自动推定(rapid automated presumptive, RAP)等[1-2]。分子生物学检测方法包括PCR，多重PCR，实时荧光PCR[3]，16SrRNA基因测序[4]，布鲁斯阶梯PCR[5]，以及近年来倍受关注的LAMP技术[6]。确诊布病一般需通过两种或两种以上方法互相验证。

1 荧光偏振技术的原理和应用

众所周知，光具有波粒二象性，可以在任一平面均匀振动行进，当光通过某一平面时，会因平面作用而分成不均匀的能量光束，光的振动平面就发生了变化，在某一个方向振动强于其他平面，这种光就是偏振光。将光通过含有某种分子的溶液时，根据光的振动平面扭转的方向和角度，可以对该分子进行推断。荧光偏振分析(FPA)的基本原理是：某一分子在液体介质中的自旋速度与其分子质量有关，分子质量越小其自旋速度越快，偏振光束去极化越高，而分子质量越大自旋速度越慢，偏振光越弱。FPA以mP(milli-Polarization level)为单位测定分子的去极化程度。用异硫氰酸盐标记(FITC)某种特异性抗原/抗体，若检测样本中存在该病抗体/抗原，抗原抗体结合后立即观察结果，则可通过相关仪器检测到产生的大量荧光复合物。在阴性样本中，抗原/抗体呈现非复合状态，由于该单体物质的分子量较小，自旋较快，因此，产生的去极化光较阳性复合物强[7]。

该方法不受溶液颜色、仪器灵敏度变化的影响，操作简单，检测时间短，适用于高通量样本筛选，广泛地应用于农药和兽药残留分析、食品真菌毒素污染检测、单核苷酸多态性筛选、实时荧光定量PCR-FP技术、核酸结构变化、蛋白激酶活性、体外细胞损伤、受体-配体和多态-配基等方面的研究[7-8]。FPA应用于致病微生物抗体检测也有许多报道，如人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、异烟肼结合分支杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、牛分支杆菌等。

2 荧光偏振技术检测布鲁氏菌抗体

FPA技术已经用于北美和欧洲的布病根除计划，是OIE规定的“贸易适用”方法。O型脂多糖是牛鲁氏菌、羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌等的共有抗原表位。常将牛布鲁氏菌S1119.3株的O型脂多糖作为抗原，并标记异硫氰酸荧光素来检测布鲁氏菌抗体，作为诊断病畜感染布病的依据。

2.1牛布鲁氏菌抗体的检测 在检测统计中，将敏感性和特异性的值相加定义为性能指数(Performance Index，PI)，在牛血清检测中的性能指数，FPA和CELISA和IELSA水平相当，比CFT和BPAT要好。检测免疫动物时，FPA和CELISA的特异性优于IELSA。

2.1.1牛血清中布鲁氏菌抗体的检测 自1996年起，就开始了FPA结合其它血清学方法对牛布鲁氏菌的检测。当时，对9 480份经BPAT、CFT、IELISA、CELISA检测过的血清进行了FPA试验。这些血清中，有561份来自曾经从组织或者牛奶中分离出布鲁氏菌的牛，8669份来自流行病学和血清学均为阴性的牛，250份来自免疫后不同时期的牛。当cut-off值为90 mP时，FPA的敏感性和特异性分别是99.02%、99.96%，均高于其他方法[9]。

对1947份布鲁氏菌培养阴性牛样品和146份阳性牛样品进行检测，FPA和CELISA进行的双ROC方法分析，当cut-off值为15.5 mP时，FPA的敏感性和特异性为99.1%和96.6%[10]。运用FPA、CFT、RIV、RBT方法对墨西哥的568份牛血清进行检测，RBT的敏感性和特异性为98.3%、68.8%，RIV的敏感性和特异性为99.3%、55.4%，而FPA在cut-off值为89.9 mP时，敏感性和特异性为99.0%、96.9%，FPA的PI值最高。CFT和FPA的卡方值为0.96，说明FPA操作方便，但可以获得与CFT相同的结果，可以做为CFT的替代方法[11]。

为了评价FPA的田间应用价值，分别对新鲜的全血、贮存全血和血清进行了检测。423份新鲜全血检测结果显示，cut-off值为105 mP时，其敏感性和特异性分别为95.3%、97.3%。对1114份贮存全血进行检测，cut-off值为95 mP时，其敏感性和特异性均为100%。对1 114份血清进行检测，cut-off值为90 mP时，其敏感性和特异性均为100%。对691份全血及与之对应的血清进行了FPA检测，当cut-off为95 mP时，敏感性和特异性分别为98.6%、98.9%，cut-off为90 mP时，敏感性和特异性分别为98.6%、100%[12]。

2.1.2奶样品中布鲁氏菌抗体的检测 乳环试验是检测牛奶中含有布鲁氏菌抗体的一种经典的方法，但是不适于保存超过48 h后乳品样品。选取1 276份经MRT检测为阳性的牛奶样品和2 974份阴性牛奶样品，分别用IELISA、CELISA、FPA方法进行检测。当FPA的cut-off值定为90 mP时，其敏感性为82.2%，特异性为99.4%。虽然IELISA的敏感性和特异性均接近100%，但是不能区分疫苗抗体和感染抗体。FPA敏感性相对较低，可能是MRT和IELISA方法检测到疫苗抗体而产生假阳性[13]。对219份阴性奶缸奶样和39份阳性奶缸奶样的检测中发现，FPA的敏感性和特异性可以达到100%和95.9%[14]。

2.1.3野牛布鲁氏菌抗体的检测 对检测野牛血清中的布鲁氏菌进行了预试验，这些血清来自无布病临床症状和流行病学证据的地区，实验采用2807份阴性血清，38份阳性牛血清样品。5种血清学方法比较发现，IELISA的敏感性虽然很高，但是不能区分疫苗抗体和野毒感染抗体，也不能区分布鲁氏菌和产生交叉抗体的其他细菌。FPA和CELISA相比，两者的敏感性相同，但是FPA的特异性较CELISA稍高，可以达到每1000个样品减少10个误诊样品[15]。

2010年的一项研究对美国黄石国家公园(YNP)的190份样品和来自一个私人拥有的189头野牛样品进行了检测，该研究采用了FPA、SAT、BPAT、CFT、CARD、CELISA方法。研究结果显示，FPA与其他方法相比，特异性成对协方差(pairwise covariance)为0.073～0.144(平均为0.106)，敏感性成对协方差为0或可忽略。贝叶斯分析方法表明FPA的敏感性为97.7%～98.8%，特异性为97.5%～98.1%。决策树分析(decision-tree analysis)认为，SAT平均成本最低为620美元，其次是FPA，647美元，其他血清学方法成本最低为703美元，最高为943美元。考虑到野外检测及技术发展，FPA比其他方法更有降低成本的潜力。FPA不能区分急性感染和隐性带菌个体的缺点还有待改进[16]。

2.1.4水牛布鲁氏菌抗体的检测 对890份意大利水牛血清样品(其中364份经CFT检测为阳性样品，526份为阴性样品)进行布鲁氏菌血清学检测，结果发现FPA在cut-off值为117 mP时，敏感性为92.6%，特异性为91.2%；而RBT检测水牛血清中布鲁氏菌的敏感性为84.5%，特异性为93.1%。FPA比RBT的敏感性显著较高，特异性没有明显差别。在结果分析中应用了ROC分析来评价FPA，以此来确定cut-off值，并实现最高的性能指数，提供更确切的结果。FPA技术在意大利实施的水牛检测-屠宰计划中起到重要的作用[17]。

2.2羊布鲁氏菌抗体的检测 经墨西哥官方标准(CT和CFT，CFT方法对CT检测为阳性样品进行验证试验，NOM)检测的1488份阳性和1 094份阴性山羊血清运用FPA方法复检，并进行ROC曲线分析，发现当cut-off值为89 mP时，FPA的特异性为82.1%，敏感性为82.2%。运用FPA和CT方法对1094份CFT检测为阴性的样品检测，FPA阴性检出率为82.2%，CT阴性检出率为65.1%为。对来自无布病山羊群的712份阴性样品进行检测，发现有30份样品为阳性，总体特异性为95.8%。此研究认为FPA方法比CT方法更敏感，可以检出CT检测中漏检的假阴性样品。FPA的cut-off值可以根据不同的流行病状况进行调整，可以用来进行免疫羊群的筛选，降低羊只被误杀的几率[18]。运用FPA对166份阳性绵羊血清样品和851份阴性绵羊血清样品进行检测。阳性样品细菌培养为马耳他布鲁氏菌阳性，阴性样品来自无马耳他布鲁氏菌史的健康绵羊群。结果显示cut-off值为87 mP时，FPA的敏感性和特异性分别为97.6%和98.9%。细菌分离为阳性的血清样品产生的免疫反应较强，抗体滴度高，易检测，用这种血清做阳性参考血清，会同时提高血清学方法的敏感性和特异性。为了评价的客观性，重新选择了587份样品对FPA进行评价。这些样品来自羊布鲁氏菌感染绵羊群，并且应用RBT、m-RBT、CFT、IELISA、CELISA中的至少两种方法同时检测为阳性。发现cut-off值为87 mP时，FPA敏感性为95.9%，仍较其他方法高[19]。

除了对血清的检测外，还应用FPA等血清学方法对免疫Rev-1疫苗的血清抗体进行了研究。多数绵羊免疫后21 d，FPA、RBT、m-RBT、CFT及CELSIA方法均可以检测到抗体，而IELSIA直到免疫后42 d才可以检测到抗体。FPA对免疫63 d的羊羔的抗体检测的方法特异性最高，与其他方法相比，差异显著。利用FPA，CELISA和CFT对免疫后330 d的成年羊进行抗体检测，3种方法差异不显著。FPA和CELISA对青年羊和成年羊免疫抗体检测显示早期抗体检测特异性较其他方法高。在执行检测屠宰政策的地区，所有血清学方法对免疫后的120天羊群检测准确率都较高，而FPA配合CELISA方法可以显著提高根除计划的效率[20]。

LPS抗原容易和羊布鲁氏菌Rev.1株疫苗及肠炎耶尔森氏菌OI∶9型产生交叉反应。按照OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)2004版》中传染病诊断方法验证规则，将FPA常用的LPS O型抗原(OPS)替换为马耳他布鲁氏菌Rev.1株疫苗的天然半抗原(native hapten，NH)。两种抗原标记的FPA方法对48份阳性样品和96份阴性样品进行检测发现，当cut-off值为86 mP时，NH抗原FPA的敏感性和特异性性分别为95.7%、99%，OPS标记的FPA方法敏感性特异性分别为91.3%、99%[21]。对NOM检测的1009份阳性样品和2 039份阴性样品进行检测，NHFPA的cut-off值为107.5 mP，敏感性和特异性分别是79.5%、84.3%；OPSFPA的cut-off值为95.3 mP时，敏感性和特异性分别是75.9%、81%。ROC分析认为NHFPA比OPSFPA具有4%的优越性。并且NHFPA仅使用10 μL血清，比OPSFPA使用的25 μL或40 μL少。在随后的研究中发现，如果仅仅使用NOM的RBT3方法假阳性率为67.3%，使用CFT(>1∶4)方法对RBT3筛查阳性进行确诊试验，假阳性率为34.5%，而使用NHFPA对RBT3筛查阳性进行确诊试验，假阳性率可以降到5.5%。NHFPA配合RBT3方法对疫苗使用率较高的地区和流行率严重地区更有效[22]。

2.3猪布鲁氏菌抗体的检测 FPA和其他几种血清学实验方法相比，只需要加入抗原，不需要洗涤步骤，5 min之内即可完成试验，并且可以在野外操作，成本较低，容易实现大通量检测，其结果可以和间接ELISA相媲美。利用几种血清学方法对14037份加拿大无布病猪血清和401份染病猪血清进行检测，发现FPA方法进行猪布鲁氏菌病检测其敏感性和特异性均比较高。可以采取FPA方法检测猪群中布病达到净化目标[23]。需要注意的是，如果使用冻干血清进行检测的时候，溶解血清后，可能产生较大的复合物，导致阴性血清的偏振值升高，从而降低了敏感性[24]。

2.4鹿布鲁氏菌抗体的检测 对1991、1994、1998年保存的北美驯鹿、麋鹿、马鹿、黇鹿、北欧驯鹿样品检测中发现FPA的敏感性和特异性与cELISA相当。FPA可以将疫苗抗体及交叉抗体，如肠结肠炎耶尔森氏菌O:9等细菌产生的抗体，与布鲁氏菌产生的抗体相区分。与FPA方法相比，CFT实验的程序繁琐，特异性受抗补体处理影响较大，另外抗补体处理血浆容易凝血，所以此方法不适于鹿布病的检测；BPAT在样品处理过程中容易使血浆形成纤维素，影响了结果的判定；IELISA的阳性结果和BPAT结果一致，但特异性不及cELISA和FPA，且不能区分疫苗抗体和交叉反应抗体。在对免疫了流产布鲁氏菌19株的麋鹿样品进行检测发现，从特异性来看，FPA为84%，cELISA为51%，BPAT为14%，CFT为31%。FPA比较适合进行鹿群布病的检测[25]。

2.5骆驼布鲁氏菌抗体的检测 应用实时荧光PCR、RBT、SAT、CFT、cELISA及FPA技术对来自苏丹的895份骆驼血清进行布鲁氏菌的检测，所有的血清学方法都检测到595份阳性样品和170阴性样品，另有72份阳性样品仅能通过FPA检测到。试验结果显示实时荧光PCR、FPA、CFT、RBT、SAT、cELISA的阳性血清检出率分别是84.8%、79.3%、71.4%、70.7%、70.6%、68.38%，敏感性分别达到91.7%、83.9%、77.2%、76.5%、76.3%、74.4%。对检测结果进行的卡方分析显示，实时荧光PCR虽然有很高的敏感性但是其特异性较血清学方法差。考虑到速度、结果的分析目的、价格等因素，FPA可以代替其他骆驼布病的检测方法，但FPA进行骆驼布病检测的重复性有待进一步研究[26]。

2.6人布鲁氏菌的检测 人布病的诊断是依靠临床症状和实验室细菌学和血清学检测方法。同时应用FPA、竞争ELISA及其他血清学方法对587份样品进行检测，FPA的敏感性达到96.1%，特异性达到97.9%。84例可疑病例中，FPA检出80例阳性病例；87例感染病例中，竞争ELISA发现了18份阳性样品，而FPA方法检测到19份阳性样品。FPA技术可以进行人感染布病的快速检测，并且可以有效进行治疗过程的监控，尤其是治疗后的布病复发的监控意义重大[27]。

3 展 望

荧光偏折技术主要用于小于160 kD抗原的测定，其检出限度在0.1～10 ng，并且与检测抗原相匹配的单抗或多抗的获得也影响了该方法的广泛应用[28]。但是，荧光偏振技术对于研究分子间相互作用是极为有用的，因为它是一个对于分子大小、结合和解离都很敏感的方法。荧光偏振技术和ELISA技术生物学反应原理相似，但操作简便，用时较短，成本低，有效区别感染抗体、免疫抗体、交叉抗体，可以进行田间使用等优势远超ELISA技术。大量的研究结果表明，在布病的抗体检测方法中，FPA的特异性和敏感性比其他血清学方法高。随着偏振荧光仪便捷性、检测费用、配套试剂的优化改进，一些人和动物疫病诊断中建立的ELISA方法，有望在一定程度上被FPA所取代。

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