贵州省8例空肠弯曲菌病例的病原学诊断与分析

韦小瑜，李世军，游 旅，田克诚，唐光鹏，王定明

空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)属于微需氧革兰氏阴性弯曲菌，是引起人类急性腹泻常见的人兽共患病原菌[1]。在许多国家的腹泻患者中所占的比重已居首位，部分国家亦仅次于沙门菌或志贺菌。在发达国家则居食源性感染首位，同时也是食源性感染性疾病的主要监测病原菌。发展中国家空肠弯曲菌的感染率明显高于发达国家，通常为发达国家的10～100倍[2]。贵州省从2010年开始对感染性腹泻病例中空肠弯曲菌的感染状况进行了监测，发现贵州省腹泻人群中存在空肠弯曲菌的感染，且主要感染人群为婴幼儿，其检出率仅次于沙门菌，与志贺菌检出率相同[3]。空肠弯曲菌作为食源性病原菌，主要是通过食用被污染的食物、水以及奶制品等而感染，因此，对疑似病例进行病原学分析，了解其分子流行病学特征对空肠弯曲菌病的预防和控制具有重要意义。本研究对贵州省8例空肠弯曲菌病疑似病例进行病原学诊断及脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)分析，为贵州省空肠弯曲菌病的确诊及分子流行病学特征提供科学依据。

1 材料和方法

1.1病例资料 8例空肠弯曲菌疑似病例中7例来自2010年4-11月贵州省感染性腹泻监测散发病例，编号为GZ201001～GZ201007，分别来自贵阳市开阳县1例、花溪区1例、金阳新区1例、云岩区1例、南明区2例，小河区1例，发病年龄均为1岁以内的婴幼儿，均有大便性状的改变如粘液便、水样便及稀便，腹泻次数3～10次/d，病程2～6 d，无发热等其他伴随症状；1例来自2012年菌血症患儿GZ201201，出生11 d，系铜仁市九仓镇家中生产，因出现“全身皮肤剥脱”就诊于遵义医院，入院时出现低热，医院抽血作血培养提示“弗朗西斯菌”可疑菌，送贵州省疾病预防控制中心鉴定为空肠弯曲菌可疑菌株。

1.2主要试剂 哥仑比亚培养基(OXOID，英国)，脱纤维羊血及选择性添加剂(北京友康基业公司)，限制性内切酶SmaI(TaKaRa，大连宝生物)，蛋白酶K(Merck，德国)，Seakem Gold琼脂糖凝胶(Bio-Rad，美国)。

1.3主要仪器 微氧培养箱为CB150(Binder，德国)；PCR仪为德国80W-Tprofessional Gradient 96，脉冲场凝胶电泳仪为CHEF mapperⅡ型(Bio-Rad，美国)，凝胶成像系统为Gel Doc2000型(Bio-Rad，美国)。

1.2方法

1.2.1细菌分离培养 将可疑菌接种至哥仑比亚选择性血平板，42 ℃微需氧培养箱(85%N2，10%CO2，5%O2)培养2 d观察可疑菌落形态。

1.2.2传统方法对疑似菌株的鉴定 将可疑菌落进行氧化酶和过氧化氢酶试验，如皆为阳性，则涂片做革兰氏染色。空肠弯曲菌为革兰氏阴性菌，呈S形、海鸥状、逗点状。如以上均符合再做马尿酸盐水解试验，空肠弯曲菌马尿酸盐水解试验阳性。

1.2.3多重PCR方法对疑似菌株的鉴定 按照参考文献[4]提供的16sRNA、mapA引物序列和参数对疑似菌株核酸进行扩增，同时采用中国疾病预防控制中心传染病控制所提供的参考菌株核酸作为阳性对照，超纯水作为阴性对照。

1.2.4分离菌株的PFGE分析 PFGE分型分析方法按照PulseNet推荐的空肠弯曲菌PFGE标准方法进行分型，获得的PFGE图像应用BioNumerics (Version4.0)软件进行聚类分析。

2 结 果

2.1细菌分离培养结果 可疑菌培养2～3 d后，观察菌落形态，菌落不溶血，灰色、扁平、湿润、有光泽，看上去像水滴，直径为1～2 mm，边缘完整、发亮，符合空肠弯曲菌的菌落形态特征。

2.2传统方法鉴定结果 氧化酶、触酶、马尿酸盐水解试验均阳性；革兰染色为革兰阴性短小杆菌，呈逗点状、S形、海鸥状。

2.3多重PCR检测结果 8株分离株均获得857 bp(16sRNA)及589 bp(mapA)两条特异性条带，与阳性对照一致。

2.4PFGE带型 8株空肠弯曲菌菌株经限制性内切酶SmaI酶切及PFGE 后，产生不同条带的PFGE 带型的图谱，8株菌共分为7个PFGE 带型，产生7～10条DNA条带(见图1)。

图1贵州省空肠弯曲菌分离株PFGE图

Fig.1PFGEpatternsofC.jejunistrainsisolatedinGuizhouProvince

M: DNA marker; 1-7: GZ201001-GZ201007;8: GZ201201.

2.5PFGE谱型聚类分析结果 GZ201004和GZ201005两株腹泻病例空肠弯曲菌分离株相似性性为100%，人血培养分离株GZ201201与腹泻病例分离株GZ201007相似性为66.7%(见图2)。

3 讨 论

贵州省自从1988年报道过12例婴幼儿空肠弯曲菌病例后[5]，直至2010年，贵州省未见空场弯曲菌的人间病例报告。2010年我们对贵州省腹泻人群细菌病原谱监测中发现7例疑似空肠弯曲菌感染病例，2012年血培养发现1例空场弯曲菌病疑似病例，为了对病例进行病原学诊断，了解分子流行病学特征，我们采用传统生化鉴定和多重PCR鉴定相结合方法，证实8例均为空肠弯曲菌感染，采用PFGE技术揭示了8株菌株的分子流行病学特征。

图2贵州省8株空肠弯曲菌PFGE图谱聚类分析图

Fig.2Clusteranalysisof8C.jejunistrainsisolatedinGuizhouProvince

传统的革兰氏染色、氧化酶和过氧化氢酶试验可将疑似菌株鉴定为弯曲菌属，但是不能从种的水平进行鉴定，本研究中采用基于16sRNA、mapA两个基因的PCR技术将8株可疑细菌鉴定为空肠弯曲菌，结合病例资料证实了8例疑似病例均为空肠弯曲菌感染所致。

目前空肠弯曲菌的分型方法主要有表型分型和基因分型两种，表型分型方法常采用血清学分型法，由于血清学分型的分型率和分辨力不高，可靠性和重复性不佳，所以传统的表型分型法在流行病学调查中的应用受到限制[6]。PFGE是20世纪80年代出现的分析大分子DNA片段的新技术，检测的是整个细菌染色体上所有酶切位点的变化，从整体上反映不同菌株全部基因的相关性[7]，该方法的发展成熟为细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。为了解贵州省空肠弯曲菌的分子流行病学特征，我们将实验室分离的8株空肠弯曲菌进行PFGE分析结果将其为7个PFGE带型，其中GZ201004和GZ201005两株腹泻病例空肠弯曲菌分离株相似性为100%，提示两株菌株可能为同一来源。其次，聚类分析也显示了8株菌的相似性仅约为45%，表明8株菌株具有PFGE带型的多态性，提示贵州省空肠弯曲菌病疫情防控的复杂性。

本研究为8例空肠弯曲菌病疑似病例的确诊提供病原学依据的同时，揭示了贵州省空肠弯曲菌的分子流行特征，其结果将为贵州省空肠弯曲菌病疫情的预防和控制提供科学依据。然而，由于在自然界中，空肠弯曲菌广泛存在于鸡、鸭、牛、羊等家禽，家畜以及鸟类的肠道内，构成空肠弯曲菌的体外储存宿主，空肠弯曲菌污染的肉、奶、蛋以及水源等是空肠弯曲菌感染的主要传染源[8]。因此，空肠弯曲菌病的有效控制应在对人间病例监测的同时，需加强动物空场弯曲菌病的防控以及食源性空肠弯曲菌的监测。此外，本次研究中采用的病例数只有8例，受分离菌株的局限，其研究结果揭示的空肠弯曲菌分子流行特征是否具有充分的代表性尚需进一步研究。

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