鸡源肠炎沙门氏菌对抗菌药物的耐药性分析

陆 彦，吕 安，赵红玉，侯晓林，吴国娟

沙门氏菌是一种重要的人兽共患病原菌，它不仅能够引起家禽的各种疾病，并且能够通过污染的禽肉造成人类沙门氏菌感染，直接威胁人体健康[1]。国内外由于沙门氏菌造成的食物中毒和食源性疾病案例一直排名前列[2]。长期以来，在农业和畜牧业中大剂量不合理的使用抗菌药物导致沙门氏菌的耐药性日趋严重，耐药菌株不断增加，耐药谱逐年变宽，耐药机制越来越复杂。相关监测数据表明，整个沙门氏菌属的多重耐药率已从20世纪90年代的20%～30%增加到了本世纪初的70%[3]。张秀丽等[4]对2006-2007年河南省生肉食品中121株沙门氏菌进行了12种抗生素的药敏试验，总体上受试菌株对12种抗生素均表现耐药。Biendo等[5]对51株人员鼠伤寒沙门氏菌的耐药情况调查表明，90%以上的菌株对磺胺类药物、氨苄西林、链霉素和四环素耐药。肠炎沙门氏菌是沙门氏菌属致病血清型之一，目前国内关于肠炎沙门氏菌耐药性研究较少。鉴于此，本试验从山东省部分地区不同场所采集沙门氏菌，对分离出的沙门氏菌株进行药物敏感性试验和耐药基因检测，了解该地区沙门氏菌耐药情况，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1培养基及药品 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、MH肉汤、科玛嘉沙门氏菌显色培养基购自北京奥博星生物技术有限公司。氨苄西林、四环素、磺胺异恶唑、萘啶酸等抗菌药物标准品购自中国兽药监察所。

1.1.2菌株 试验用沙门氏菌从山东省部分地区的鸡孵化场、养殖场和屠宰场中采集，在中国山东省农科院畜牧所分离。鸡白痢沙门氏菌标准菌株CVCC533、鼠伤寒沙门氏菌标准菌株CVCC541、大肠杆菌ATCC25922购自中国兽药监察所。

1.2方法

1.2.1菌株分离、鉴定和血清分型 将样品置于无菌亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液中37 ℃恒温培养12～24 h，增殖培养液划线接种于科玛嘉沙门氏菌显色培养基37 ℃恒温培养24 h后观察菌落形态特征，紫色边缘整齐的单个菌落判定为疑似沙门氏菌。菌株纯化培养后通过PCR方法检测分离株invA基因[6]，阳性菌株确认为沙门氏菌。

采用宁波天润60种沙门氏菌属诊断血清，通过玻片凝集法对沙门氏菌进行血清型鉴定，根据Kauffmann-White抗原表检索沙门氏菌血清型。鸡白痢沙门氏菌标准菌株CVCC533和鼠伤寒沙门氏菌标准菌株CVCC541为阳性对照，生理盐水为阴性对照。

1.2.2药物敏感性试验 采用临床实验室标准化委员会(CLSI)[7]推荐的微量肉汤稀释法对分离株进行19种临床常用抗菌药物的MIC值测定，测试的药物为：氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢噻呋、头孢唑啉、达氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、萘啶酸、氟苯尼考、氯霉素、磺胺甲恶唑、磺胺异恶唑、甲氧苄啶、四环素、多西环素、多粘菌素、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素。以大肠杆菌ATCC25922做药敏试验质控菌，结果判定参照CLSI标准。

1.2.3PCR扩增和序列分析 根据药敏试验结果，参照GenBank中登陆的耐药基因序列及相关文献[8-9]设计合成引物，扩增Ⅰ型整合酶基因和3′-保守端基因，其引物见表1。另外设计合成了12对引物，分别扩增萘啶酸、青霉素类、四环素类耐药基因，PCR引物序列及大小见表2。PCR反应体系总体积为20 μL，包括模板DNA l μL；10 nmol/L的上下游引物各1 μL；双蒸水7 μL和2×PCR Mix10 μL。PCR 扩增条件见表3。采用凝胶试剂盒回收、纯化耐药基因的PCR扩增产物，进行序列测定，并与GenBank中的相应耐药基因序列进行同源性分析。

1.2.4脉冲场凝胶电泳(PFGE) 用限制性内切酶XbaI将鸡孵化场、养殖场和屠宰场同时携带有Ⅰ型整合酶基因、3′-保守端基因、blaTEM和tetA的菌株进行DNA染色体消化分解，根据美国Pulse Net标准实验室规程推荐的CHER Mapper脉冲场凝胶电泳系统对其进行凝胶电泳。以Salmonellaserovar Braenderup H9812作为PFGE相对分子质量的标准菌株。电泳结果使用Bio-rad公司的Info Quest FP(Version 4.5)软件进行图像分析和数据处理。

表1 沙门氏菌整合子的PCR引物序列

表2 沙门氏菌耐药基因的PCR引物序列

表3 PCR反应运行参数

2 结 果

2.1细菌的分离鉴定 本研究从山东省部分地区鸡孵化场、养殖场、屠宰场3个来源992个样品中分离出178株肠炎沙门氏菌，分离率为17.94%。阳性肠炎沙门氏菌在孵化场中分离率最高为58.08%(115株)；鸡养殖场中分离率为9.58%(23株)；鸡屠宰场中分离率为7.22%(40株)，见表4。

表4 不同来源沙门氏菌分离率

2.2药敏试验 从药物敏感性实验结果看出(见表5)，肠炎沙门氏菌耐药情况比较严重，在178株分离株中，100%的菌株对萘啶酸/磺胺甲恶唑产生耐药性，为19种供试抗菌药物中最强。耐磺胺异恶唑的肠炎沙门氏菌株比例为88.76%、氨苄西林为68.54%、四环素为66.85%、甲氧苄啶为64.61%、多西环素为34.27%、阿莫西林-克拉维酸为33.71%、头孢噻呋和头孢唑啉均为7.3%、氯霉素为5.62%、达氟沙星为3.37%、卡那霉素、诺氟沙星为2.25%、恩诺沙星和多粘菌素为1.12%。肠炎沙门氏菌对氟苯尼考、庆大霉素、阿米卡星比较敏感，耐药率均为0.56%。

表5 肠炎沙门氏菌耐药率

2.3耐药基因检测 125株青霉素类耐药的菌株中有110株检测到blaTEM基因，检出率达到88%，没有扩增出blaPSE基因。其中120株具有氨苄西林耐药表型的菌株中112株携带blaTEM基因，占93.3%；124株四环素类耐药的菌株中有102株检测到tetA基因，检出率为82.25%。未检测到tetB、tetC、tetD和tetG基因；178株肠炎沙门氏菌株中有86株检测到IntⅠ，检出率为48.3%。所有IntⅠ基因阳性菌株均扩增到了3′-保守端基因；萘啶酸耐药菌株中检测到5株携带qepA基因，未检测到qnrA、qnrB、aac(6′)-Ib-cr、qnrS基因(见表6)。

表6 含耐药基因的菌株数与耐药菌株数的比较

2.4脉冲场凝胶电泳 挑取不同场所耐药菌株进行脉冲场凝胶电泳，通过PFGE分析产生14-17条带，条带分子量大小范围在20～1 100 kb之间。从图1中可以看出，通过软件的聚类分析，不同场所分离的10株肠炎沙门氏菌可以分为4个型(同源性80%以下)，其中分离自同一场所的肠炎沙门氏菌呈现基本相同的PFGE谱型，如来自孵化场的C76、C58；来自屠宰场的MHY2、507、251；也有分离自不同养殖场的肠炎沙门氏菌呈现较为接近的亲缘关系，如来自孵化场的C76、C58和屠宰场的MHY2、507、251；另外，同一场所不同PFGE谱型的有养殖场分离株:43、34、L3。

图110株肠炎沙门氏菌的PFGE图谱

Fig.1PFGEpatternoftenstrainsofSalmonellaenteritidis

Chicken hatchery: C76, C58, C135; Chicken farm: 43, 34, L3; Slaughterhouse: MHY2, MHJY, 507, 251; Marker:SalmonellaH9812.

3 讨 论

本次研究中我们从山东省部分地区鸡孵化场、养殖场和屠宰厂采集沙门氏菌样品，经分离、鉴定其主要血清型为肠炎沙门氏菌，这与大多数国家所分离到的优势血清型基本一致。美国和欧盟2010年从肉鸡中分离的沙门氏菌主要以肠炎、肯塔基血清型为主[10-11]；杨保伟等[12]对陕西省2007-2008年部分零售畜禽肉沙门氏菌血清型研究显示，鸡肉源沙门氏菌以肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌为主。值得注意的是，此次研究中肠炎沙门氏菌在鸡孵化场弱雏中分离率很高，达58.08%。由此可以看出肠炎沙门氏菌是山东省鸡孵化场中正在盛行的高致病性沙门氏菌血清型，很可能是弱雏的致死菌。

从药敏试验结果看，本次研究中大部分沙门氏菌对氨苄西林和四环素产生了较高的耐药性。赵爱华等[13]对2010-2011年江苏泰州周边地区分离的肠炎沙门氏菌进行药物敏感性检测发现肠炎沙门氏菌对氨苄西林和四环素的耐药率分别为74.2%和64.5%，与本研究结果基本一致。廖成水等[14]的研究中氨苄西林和四环素的耐药率分别为61.22%和19.39%，明显低于本实验结果，分析原因可能与菌株来源、不同地区用药情况、饲养管理等方面有密切关系。

细菌的耐药机制是复杂的，其遗传机制主要是由耐药基因直接编码蛋白或基因作用位点发生突变[15]。目前研究表明，细菌对四环素类抗菌药物的耐药主要是由于获得了有关结合质粒或转座子中新的四环素耐药基因tet。tet种类繁多，已鉴定出30多种，其中tetA、tetB、tetC、tetD、tetG[16]等在沙门氏菌中发生率较高。Peirano[17]和Fan[18]等分别对135株沙门氏菌和107株革兰氏阴性菌进行分析，菌株四环素耐药主要由tetA和tetB介导。本研究中124株四环素类耐药的菌株中有102株检测到了tetA，与以上报道相似，没有发现tetB、tetC、tetD和tetG，tetA检出率为82.25%，说明tetA在山东省部分肉鸡生产场所广泛流行 。

细菌对青霉素类抗菌药物产生耐药性主要是由于产生β-内酰胺酶，从而水解β-内酰胺类抗菌药物酰胺环上的酰胺键。β-内酰胺酶家族包括的酶类相当广泛，根据基因来源和进化关系可分为TEM型、SHV型、CTX型和OXA型等。目前，从沙门氏菌中检测到的β-内酰胺酶耐药基因有blaTEM、blaPSE、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M等[16]。本次研究中我们从110株青霉素类耐药的菌株中扩增到blaTEM基因，检出率达88%，比廖经忠等[19]报道的142株革兰氏阴性肠杆菌blaTEM检出率为59.9%这一结果要高，说明blaTEM广泛流行于山东省鸡源肠炎沙门氏菌中，且青霉素类耐药主要由blaTEM基因介导。

细菌耐药问题已经成为一个世界性的难题，研究山东省食源性沙门氏菌的药敏性特征及与耐药性产生的相关基因，有助于从食物链的源头和食品性动物生产中采取合理的干预措施，减少和防止沙门氏菌耐药性的产生，保障食品安全。同时，也对更好的了解沙门氏菌的耐药机理和有效控制日趋严重的沙门氏菌耐药性问题提供了依据。

参考文献：

[1]Ding MJ, Gao JY, Tang Y, et al. The isolation, identification and biological characteristics research ofSalmonellaEnteritidis from broiler[J]. China Anim Husbandry Vet Med, 2009, 36(5): 203-209. (in Chinese)

丁孟建, 高继业, 唐妤, 等. 肉鸡源肠炎沙门氏菌的分离与鉴定及生物学特性观察[J]. 中国畜牧兽医, 2009, 36(5) : 203-209.

[2]Xu XB, Gu BK, Ran L, et al. Sourcing research on rare serotypeSalmonelladiarrhea in Shanghai[J]. Shanghai J Prev Med, 2009, 21(1): 7-9. (in Chinese)

许学斌, 顾宝柯, 冉陆, 等. 上海市罕见沙门菌型腹泻的溯源研究[J]. 上海预防医学杂志, 2009, 21(1) : 7-9.

[3]Ren XB, Tang DY, Yang ZP, et al. Progress on studies of antibiotic resistance ofSalmonellafrom swine[J]. Swine Industry Sci, 2009, 26(12): 36-39. (in Chinese)

任学兵, 汤德元, 杨泽平, 等. 猪沙门氏菌耐药性的研究进展[J]. 猪业科学, 2009, 26(12) : 36-39.

[4]Zhang XL, Liao XG, Hao ZY, et al. Pro-active monitoring and establishment of DNA fingerprint database ofSalmonellain raw meat food in Henan Province during 2006-2007[J]. Chin J Health Lab Technol, 2009, 19(7): 1545-1548. (in Chinese)

张秀丽, 廖兴广, 郝宗宇, 等. 2006-2007年河南省生肉食品中沙门菌的主动监测及其DNA指纹图谱库的建立[J]. 中国卫生检验杂志, 2009, 19(7) : 1545-1548.

[5]Biendo M, Laurans G, Thomas D, et al. Molecular characterization and mechanisms of resistance of multidrug-resistant humanSalmonellaentericaserovar typhimurium isolated in Amiens[J]. Int J Antimicrobial Agents, 2005, 26(3): 219-229. DOI:10.1016/j.ijantimicag.2005.05.003

[6]Wang MY, Xu MH, Pan HW, et al. Establishment and preliminary application of LAMPinvA gene assay for rapid detection ofSalmonella[J]. Chin J Health Lab Technol, 2008, 18(10): 23-26. (in Chinese)

王敏雅, 徐明汉, 潘宏伟, 等. 沙门菌invA基因LAMP快速检测法的建立和初步应用[J].中国卫生检验杂志, 2008, 18(10) : 23-26.

[7]CLSI M31-A3, Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals; Approved Standard-Third Edition[S]. USA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008: 101-110.

[8]Ng LK, Martin I, Alfa M, et al. Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes[J]. Mol Cell Probes, 2001, 15(4): 209-215. DOI:10.1006/mcpr.2001.0363

[9]Yan L, Cong MW, Guo JW, et al.Prevalence of antimicrobial resistance amongSalmonellaisolates from chicken in China[J]. Food Borne Pathog Dis, 2011, 8(1): 45-53. DOI:10.1089/fpd.2010.0605

[10]USDA. National Antimicrobial Resistance Monitoring System Enteric Bacteria, Animal Arm (NARMS): 2010 NARMS Animal Arm Annual Report[R]. Athens, GA: U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, 2012: 18.

[11]Euro surveillance editorial team. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2010[J]. Euro Surveill, 2012, 17(10): 71-94.

[12]Yang BW, Zhang XL, Qu D, et al. Serotypic and genotypic characterization ofSalmonellaSerovars from retails meat in Shanxi province (2007 -2008)[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2010, 50(5): 654-660. (in Chinese)

杨保伟, 张秀丽, 曲东, 等. 2007-2008陕西部分零售畜禽肉沙门氏菌血清型和基因型[J].微生物学报, 2010, 50(5) : 654 -660.

[13]Zhao AH, Huan HH. The isolation ofSalmonellaEnteritidis from chicken and drug sensitivity analysis[J]. Jiangsu Agr Sci, 2012, 40(6): 207-209. (in Chinese)

赵爱华, 还红华. 鸡肠炎沙门氏菌的分离和药物敏感性分析[J]. 江苏农业科学, 2012, 40(6) : 207-209.

[14]Liao CS, Cheng XC, Zhang CJ, et al. Antimicrobial resistance and resistance genes of pathogenicSalmonellarecently isolated from chicken[J]. Chin Vet Sci, 2011, 41(7): 751-755. (in Chinese)

廖成水, 程相朝, 张春杰, 等. 鸡源致病性沙门氏菌新近分离株的耐药性与耐药基因[J].中国兽医科学, 2011, 41(7) : 751-755.

[15]Wei XL, Chen ZL. Characterization of mutations in gyrA and gyrC of clinical and experimental inductive of fluroquinolone-resistantSalmonellastrains[J]. Chin J Vet Med, 2006, 42(9): 6-8. (in Chinese)

魏秀丽, 陈杖榴. 沙门氏菌耐药株gyrA基因和parC基因突变特征分析[J]. 中国兽医杂志, 2006, 42(9) : 6-8.

[16]Michael GB, Butaye P, Cloeckaert A, et al. Genes and mutations conferring antimicrobial resistance inSalmonella: an update[J]. Microbes Infect, 2006, 8(7): 1898-1914. DOI:10.1016/j.micinf.2005.12.019

[17]Peirano G, Agerso Y, Aarestrup FM, et al. Occurrence of integrons and antimicrobial resistance genes amongSalmonellaEnterica from Brazil[J]. J Antimicrobial Chemother, 2006, 58(2): 305-309. DOI:10.1093/jac/dkl248

[18]Fan W, Hamilton T, Webster SS, et al. Multiplex real-time SYBR Green Ⅰ PCR assay for detection of tetracycline efflux genes of Gram-negative bacteria[J]. Mol Cell Probes, 2007, 21(4): 245-256. DOI: 10.1016/j.mcp.2006.12.005

[19]Liao JZ, Liu WE, Li HL, et al. Study on drug resistance genes of TEM type β-lactamases produced by gram-negative bacteria[J]. China J Modern Med, 2010, 2(13): 1957-1966. (in Chinese)

廖经忠, 刘文恩, 李虹玲, 等. 革兰阴性杆菌TEM型β-内酰胺酶耐药基因研究[J]. 中国现代医学杂志, 2010, 2(13): 1957-1966.